课题组前期研究发现流经重庆城区的嘉陵江及长江水水源中邻苯二甲酸酯(PAEs)和多环芳烃(PAHs)污染特别突出,而邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和苯并(a)芘(BaP)分别是这两种化合物的典型代表。邻苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘都是持续性有机污染物,也属于公认的环境内分泌干扰物。由于它们常常共存于水中,对人体的暴露属于低剂量联合暴露。虽然已有研究认为DBP和BaP均有雄性生殖毒性,但到目前为止还没有见到这两种化合物同时暴露对生殖毒性的影响的报告,因此,很有必要对两者的联合作用进行研究。同时,已有大量研究发现DBP和BaP可能通过睾丸细胞,如支持细胞、Leydig细胞、及生精细胞来影响睾丸的功能,而对于睾丸巨噬细胞的研究却没有。由于睾丸巨噬细胞作为一类特殊的免疫分泌细胞与Leydig细胞比邻于睾丸间质,对维持睾丸内环境的稳定具有重要作用,也能通过旁分泌作用分泌因子调节Leydig细胞的功能。因此,本研究通过观察DBP和BaP对睾丸巨噬细胞的功能的影响以及对睾酮合成的影响,从睾丸巨噬细胞的角度来探索DBP和BaP对睾酮合成影响的内在机制,为今后的研究提供基础性的数据。方法:1、体内实验:亚慢性低剂量暴露(1)动物分组及染毒剂量大鼠被随机分成7组,24只/组,溶剂对照组(CON)、DBP 50mg/kg组(DBP-50)、DBP 250mg/kg组(DBP-250)、BaP 1mg/kg组(BaP-1)、BaP 5mg/kg组(BaP-5)、DBP 50mg/kg+BaP1mg/kg联合暴露组(D+B-50+1)、DBP 250mg/kg+BaP 5mg/kg联合暴露组(D+B-250+5)。(2)实验设计:隔日等体积灌胃,连续染毒90天。分别在染毒后的30d、60d和90d,取材,通过常规H.E染色、RT-PCR、免疫组织化学染色、Western blot、放射免疫法等方法,观察和分析DBP和BaP对一般毒理学指标、睾丸巨噬细胞功能(包括亚型表达、分泌因子的改变、吞噬相关酶的改变)以及睾丸内睾酮产量的影响。2、体外实验:体外低剂量暴露先建立体外睾丸巨噬细胞原代培养体系,预培养24小时后染毒,共分八组:空白对照组和溶剂对照组,六个染毒实验组:DBP-0.1组,DBP-10组(DBP终浓度分别为0.1μg/ml,10μg/ml),BaP-0.01组,BaP-1组(BaP终浓度分别为0.01μg/ml,1μg/ml),联合染毒组D+B-0.1+0.01组,D+B-10+1组(DBP 0.1μg/ml+BaP 0.01μg/ml; DBP 0.1μg/ml+BaP 0.01μg/ml)。染毒24小时后,收集细胞观察睾丸巨噬细胞凋亡情况,以及中性红实验检测其吞噬功能,上清则用ELISA法检测IL-1β和TNF-α水平。从体外来进一步证实和探索DBP和BaP对睾丸巨噬细胞的损伤机制。结果:1、DBP和BaP染毒后对生殖系统及其它主要脏器的一般毒理学指标的影响(1)低剂量DBP和BaP暴露对大鼠的体重和神经行为均没有明显影响。(2)对大鼠脏器系数的影响主要表现在附睾系数和肝脏系数的改变。(3)低剂量DBP和BaP暴露,对睾丸、附睾和肝脏的形态学改变明显,睾丸形态学改变特点是:各染毒组生精上皮明显减少及上皮内的空泡样变性。附睾形态改变特点主要是:管内的精子数目减少。肝脏形态学改变主要表现在:各染毒组,不论是DBP还是BaP组,都有明显的肝窦增宽的特点,而联合染毒高剂量组还可见点状肝细胞坏死。(4)低剂量DBP和BaP暴露,对附睾精子数目的影响主要表现在60天时,DBP-250组和D+B-250+5组对精子数目明显降低,联合暴露时DBP的主导作用明显。2、邻苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘对睾丸巨噬细胞内分泌功能的影响(1)DBP和BaP暴露时分泌的IL-1β在mRNA和蛋白水平都明显增高,这种mRNA在90天时才表现明显;DBP和BaP暴露与IL-1βmRNA水平的增高没有剂量依赖效应。DBP和BaP联合暴露对分泌IL-1β水平的增加呈现出相加作用,其中DBP-250组对于IL-1β蛋白水平表达的增加表现突出。(2)DBP和BaP暴露时分泌的TNF-αmRNA和蛋白水平都下降,DBP和BaP联合染毒对TNF-α蛋白表达同样具备相加的作用。(3)DBP与BaP暴露对iNOS mRNA和蛋白水平的影响总体来说是显著降低其表达水平,但是其染毒水平须保持在DBP 250mg/kg/d,BaP 5mg/kg/d的剂量水平。虽然单独暴露时,两者在低剂量水平变化不明显,但当两者在此剂量下联合暴露时,其iNOS mRNA水平出现明显降低,提示DBP与BaP能交互作用,触发与单独暴露截然不同的效应。3、邻苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘对睾丸巨噬细胞亚型的影响DBP和BaP暴露改变了睾丸巨噬细胞亚型表达的平衡,主要表现在使ED1亚型表达在90天内呈持续增高的趋势;ED2亚型先在30天时出现短暂的大幅降低(这种表现主要表现在联合暴露D+B-50+1组),然后在90天时,整体水平又逐渐回升,但高剂量联合组(D+B-250+5)依然低于对照组的平均水平,出现不可逆的改变。4、邻苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘对睾丸巨噬细胞吞噬功能相关酶的影响(1)DBP在50mg/kg/d的剂量水平单独暴露下,溶菌酶水平显著升高,存在低剂量兴奋效应。这种效应在第30及60天时表现明显。DBP和BaP联合染毒时使溶菌酶酶水平明显下降,提示非特异性吞噬功能降低。(2)DBP和BaP染毒时,具有时间效应,在90天内酸性磷酸酶(ACP)水平逐渐下降,各染毒组和联合染毒组在第90天时ACP水平均显著低于对照组。5、邻苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘对睾酮合成的影响(1)引起睾酮合成细胞---Leydig细胞的超微结构的改变,主要表现在合成场所内质网和线粒体的膜改变,如髓样改变,扩张和水肿;联合染毒时还有核的高度异常,出现固缩和核内包涵物。在不同剂量水平上,其形态学的差别不明显。(2)在90天内大部分染毒组睾丸组织内睾酮水平显著降低;DBP和BaP联合染毒后的睾酮产量明显低于单独染毒,而且DBP和BaP两者具有明显的相加效应。6、邻苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘对体外睾丸巨噬细胞损伤的机制初步探讨(1)DBP、BaP在极低剂量水平(DBP 0.1μg/ml,BaP 0.01μg/ml)就能够诱导体外睾丸巨噬细胞的凋亡;相对BaP来说,睾丸巨噬细胞对DBP的低剂量暴露更加敏感;DBP和BaP对诱导睾丸巨噬细胞凋亡存在复杂的联合作用。(2)DBP在高剂量水平单独染毒和联合高剂量染毒出现IL-1β分泌显著增高,TNF-α分泌显著减少,非特异性吞噬功能均下降,这些改变在低剂量水平(DBP 0.1μg/ml,BaP 0.01μg/ml)均不明显。结论:1、DBP和BaP低剂量染毒对动物主要脏器如睾丸、附睾和肝脏的形态学有影响,说明这三个器官可能是DBP和BaP低剂量暴露下的毒性靶器官。2、DBP和BaP低剂量联合染毒降低了附睾中的精子数目,相比较BaP而言,DBP在其中起着主体作用。3、在DBP于50mg/kg/d的水平单独暴露的初期,不同于其它染毒组,ED2水平不降反而上升,溶菌酶酶活性不减弱反而增高,这里可能都存在一种低剂量兴奋效应。4、邻苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘亚慢性、低剂量暴露后,以相加的模式共同显著降低睾酮的产量,并存在明显的剂量依赖关系。5、尽管DBP和BaP有着复杂的未知的联合作用,但在对睾丸巨噬细胞功能影响方面,相加作用可能是其主要的联合毒性作用类型。6、邻苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘暴露使睾丸巨噬细胞分泌功能出现选择性的分泌,即IL-1β的上调及TNF-α和iNOS的下调,IL-1β可能作为主要的分泌因子在睾丸局部发挥重要调节作用。7、DBP和BaP可能通过诱导(ED2亚群)凋亡、改变亚群平衡,最终局部大量分泌IL-1β,并通过它发挥抑制睾酮的生成。这个可能是DBP和BaP干扰睾酮合成的巨噬细胞途径和内在机制之一。综上所述,体内及体外实验共同证实:睾丸巨噬细胞是邻苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘的毒性靶细胞,邻苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘能够改变睾丸巨噬细胞亚群的平衡;降低非特异性吞噬功能,特别是改变重要因子的分泌,通过旁分泌途径抑制Leydig细胞的睾酮类固醇合成。显然,DBP和BaP低剂量联合暴露的主要的毒效应谱包括了睾丸巨噬细胞IL-1β分泌的上调。上调后的IL-1β如何在局部发挥其调节作用需要将来更多的深入研究来阐明。