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目的:初步探讨长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)Pvt1对粒细胞样髓源抑制性细胞(granulocytic myeloid-derived suppressor cells,G-MDSCs)免疫抑制功能的调控作用,并分析其潜在的调控机制,为进一步寻找肿瘤免疫治疗新靶点提供实验基础。方法:(1)磁珠分选野生型小鼠脾脏来源的CD11b+Ly6G+G-MDSCs,磁珠富集联合流式细胞仪分选Lewis肺腺癌移植瘤模型小鼠肿瘤组织来源的CD11b+Ly6G+G-MDSCs,流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析细胞纯度,将上述细胞进行小鼠Arraystar LncRNA表达谱芯片检测(委托上海康成生物技术公司),筛选表达差异明显的lncRNA,利用实时荧光定量PCR(real time fluorescene quantitative PCR,q RT-PCR)验证芯片检测结果;此外,利用q RT-PCR检测荷瘤小鼠骨髓、脾脏、肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNA Pvt1的表达情况。(2)分析Arraystar LncRNA表达谱芯片,筛选lncRNA Pvt1可能调控的下游靶分子,利用q RT-PCR验证芯片检测结果。在此基础上,利用q RT-PCR检测c-myc在荷瘤小鼠骨髓、脾脏、肿瘤组织来源G-MDSCs中的表达差异。利用小鼠lncRNA Pvt1特异性小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)(si-Pvt1)敲减荷瘤小鼠肿瘤组织来源G-MDSCs中的lncRNA Pvt1,q RT-PCR检测G-MDSCs中c-myc m RNA水平的变化、Western-blot检测c-myc蛋白水平的变化。(3)为了确定lncRNA Pvt1对G-MDSCs免疫抑制功能的影响,利用si-Pvt1敲减肿瘤组织来源G-MDSCs中的lncRNA Pvt1。通过3H-胸腺嘧啶核苷([3H]-thymidine,3H-Td R)掺入法检测CD4+T细胞增殖能力的变化,FCM检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)表达的变化,比色法检测精氨酸酶1(arginase 1,Arg1)活性的改变。此外,体外利用IL-6和GM-CSF联合诱导G-MDSCs,q RT-PCR比较骨髓中直接分选的G-MDSCs与体外诱导的G-MDSCs中lncRNA Pvt1表达的差异,CFSE检测CD4+T细胞增殖能力的变化,FCM检测ROS表达的变化,比色法检测Arg1活性的变化。(4)将1×106个si-Pvt1敲减G-MDSCs和0.8×106个小鼠Lewis肺腺癌细胞混合后皮下注射C57BL/6小鼠,连续监测肿瘤的生长情况,FCM检测荷瘤小鼠脾脏、局部引流淋巴结(draining lymph nodes,d LN)、肿瘤组织中Ⅰ型辅助型T细胞(Th1)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)比例的变化。(5)为了探究肿瘤局部缺氧环境是否是引起G-MDSCs细胞内lncRNA Pvt1变化的原因,q RT-PCR检测荷瘤小鼠肿瘤组织来源G-MDSCs与荷瘤小鼠脾脏来源G-MDSCs中缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的表达情况。将耗氧袋置于密闭容器中形成缺氧环境,小鼠脾脏G-MDSCs在缺氧环境培养后,利用q RT-PCR与Western-blot检测HIF-1α的表达,q RT-PCR检测lncRNA Pvt1的变化;缺氧处理G-MDSCs的同时加入HIF-1α的抑制剂YC-1,q RT-PCR与Western-blot检测HIF-1α的表达,q RT-PCR检测lncRNA Pvt1的变化。结果:(1)与野生型小鼠脾脏来源的G-MDSCs相比,荷瘤小鼠肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNA Pvt1表达水平明显增高(p<0.001);荷瘤小鼠骨髓、脾脏、肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNA Pvt1的表达水平呈现递增趋势(p<0.01)。(2)C-myc在荷瘤小鼠肿瘤组织来源G-MDSCs中表达明显高于野生型小鼠脾脏来源G-MDSCs(p<0.01),c-myc的表达在荷瘤小鼠骨髓、脾脏、肿瘤组织来源G-MDSCs中也呈现递增趋势(p<0.001),与lncRNA Pvt1的变化一致。抑制荷瘤小鼠肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNA Pvt1的表达后,c-myc的表达明显下调(p<0.05)。(3)肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNA Pvt1的表达被抑制后,其对CD4+T细胞增殖的抑制作用明显减弱(p<0.05),Arg1活性显著降低(p<0.05),ROS表达水平也明显下降(p<0.01)。此外,与骨髓中直接分选的G-MDSCs相比,IL-6和GM-CSF联合诱导的G-MDSCs对CD4+T细胞增殖的抑制作用明显增强(p<0.001),Arg1的活性显著增加(p<0.001),ROS表达水平也明显升高(p<0.05);与此同时,lncRNA Pvt1的表达水平显著增高(p<0.001)。(4)注射Lewis肺腺癌细胞和转染si-Pvt1的G-MDSCs组的小鼠(si-Pvt1组)肿瘤体积明显小于对照组(p<0.05)。si-Pvt1组小鼠引流淋巴结中CTL细胞的比例明显高于对照组小鼠(p<0.05),但si-Pvt1组小鼠脾脏、肿瘤组织中Th1细胞和CTL细胞的比例与对照组小鼠无明显差异。(5)荷瘤小鼠肿瘤组织来源G-MDSCs中HIF-1αm RNA水平明显高于脾脏来源G-MDSCs(p<0.001)。小鼠脾脏来源G-MDSCs经缺氧处理后,HIF-1α的m RNA水平(p<0.05)显著上调,HIF-1α蛋白水平升高,lncRNA Pvt1的表达也明显上调(p<0.05);G-MDSCs在缺氧处理的同时加入HIF-1α的抑制剂YC-1,lncRNA Pvt1的表达出现明显下调(p<0.001)。结论:荷瘤小鼠肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNA Pvt1的表达上调,抑制G-MDSCs中lncRNA Pvt1的表达能减弱其免疫抑制功能。