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绝大多数外源基因在大肠杆菌表达系统中是不可溶或者以无生物活性的包涵体形式存在,当前通过融合表达的策略是提高外源蛋白可溶性的有效方法之一。蛋白标签是指利用DNA体外重组技术,与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白,以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。目前,在基础研究和商业化产品生产方面应用比较广泛的蛋白标签有组氨酸标签(6x His),麦芽糖结合蛋白(MBP),谷胱甘肽巯基转移酶(GST),增强型绿色荧光蛋白(eGFP),Flag标签蛋白,小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)等。但每种蛋白标签都有自己的局限性,本研究通过将λ噬菌体来源的Beta蛋白作为融合标签分别与gfp,hRnBp,slr1975,PMT0106四个基因进行融合表达来研究单链结合蛋白(Beta)作为一种新型融合标签的可行性。将N末端含有组氨酸标签和C末端含有TEV酶切位点的beta基因片段与填充片段一起克隆至pET表达载体形成一种通用的表达载体,以便于目的基因的克隆及表达。上述四个基因分别克隆表达,无beta标签的蛋白表达做对照,通过SDS-PAGE检测,Beta-hRnBp和Beta-slr1975蛋白可溶性显著增加,约增加了 70%的可溶性,Beta-GFP表达量有所提高,但可溶性没有变化,Beta-PMT0106蛋白表达量及可溶性均无增加。通过全细胞偶联催化和TBA方法检测融合蛋白活性,发现融合蛋白活性有所提高,但不是很显著,摩尔转化率约增加了 5倍。融合蛋白纯化后通过TEV酶切后均获得预期带型。由此可见,λ来源的Beta蛋白作为融合标签具有一定的应用潜力。基于λ噬菌体的Red同源重组技术已经广泛应用与各种细菌和真菌的染色体基因组的改造。重组酶基因包括exo(redα)基因,bet(redβ)基因,gam基因,exo编码DNA 5’端至3’端的外切酶Exo,Exo作用于双链DNA分子而产生3’端突出的分子;bet编码单链结合蛋白Beta,Beta结合在Exo作用后所产生的DNA分子的3’突出端,同时还行使重组酶活性,即促进两个单链的同源DNA分子通过退火或链侵入的机制进行同源重组而获得重组分子。exo和bet操纵子中的gam基因所编码的Gam蛋白能够抑制大肠杆菌RecBCD对外源DNA的降解。本研究通过构建基于质粒的重组工程系统:阿拉伯糖诱导的Red重组酶和IPTG诱导的I-SceI及蔗糖负筛选标记基因sacB先克隆至高拷贝载体PKS之中,然后再将上述核心元件分别克隆至三种不同复制子的广宿主菌载体之中,来实现铜绿假单胞菌PAO1菌株染色体基因的无冗余碱基的一步基因敲除。通过PCR技术和酶切酶连技术成功构建了三种不同复制子的表达重组酶的质粒。