第一分部人IFN-α2b基因真核表达质粒的构建及在人骨髓间充质干细胞中的表达[目的]构建并鉴定人干扰素-α2b (IFN-α2b)基因真核表达质粒pcDNA3.1-IFN-α2b,观察重组质粒pcDNA3.1-IFN-α2b转染人骨髓间充质干细胞(BMSC)后IFN-α2b基因在BMSC中的表达,研究IFN-α2b基因转染对BMSC增殖能力和间充质干细胞特性的影响。[方法]根据基因数据库中人IFN-α2b基因的序列,应用premier 5.0软件设计人IFN-α2b基因的特异性引物。从第三代人BMSC中提取总RNA,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从总RNA中扩增IFN-α2b基因全长cDNA片断,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收IFN-α2b基因,cDNA和空质粒进行限制性内切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切,用T4DNA连接酶连接构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-IFN-α2b。重组质粒经RT-PCR鉴定及基因测序鉴定,将基因测序结果进行基因同源性比对。培养人BMSC,采用脂质体转染方法将重组质粒pcDNA3.1-IFN-α2b转染至人BMSC,qPCR检测转染后的BMSC细胞中IFN-α2b基因mRNA的表达,ELISA检测培养液中IFN-α2b蛋白的表达。倒置相差显微镜观察转染后的BMSC细胞形态；MTT法检测BMSC-IFN-α2b细胞的增殖能力。流式细胞仪检测BMSC-IFN-α2b细胞表面分子CD44、CD90、CD34和CD45分子的表达变化。转染的BMSC-IFN-α2b细胞进行成骨细胞、脂肪细胞分化诱导培养。[结果]重组质粒pcDNA3.1-IFN-α2b经PCR扩增后凝胶电泳,扩增基因片段为IFN-α2b基因片段,基因测序证实与基因数据库中公布的人IFN-α2b基因序列完全一致。qPCR检测证实人IFN-α2b基因成功转染入人BMSC细胞中。ELISA检测显示IFN-α2b蛋白可被BMSC表达并分泌至细胞外,IFN-α2b表达高峰出现于转染后第3d,转染后12h、Id、2d、3d、4d、5d、6d和7d各时间点的表达量均显著高于未转染和空质粒转染的BMSC (P<0.05)。pcDNA3.1-IFN-α2b质粒转染的BMSC细胞形态、细胞表面分子CD44、CD90、CD34和CD45的表达均无变化,转染后BMSC细胞增殖能力无显著性改变,并可继续分化诱导成骨细胞和脂肪细胞。[结论]利用RT-PCR技术成功构建了人IFN-α2b基因真核重组表达质粒pcDNA3.1-IFN-α2b。人BMSC可被重组质粒pcDNA3.1-IFN-α2b转染,并表达基因产物。人IFN-α2b基因转染的BMSC仍然保持间充质干细胞的特性。第二部分人IFN-α2b基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗肝癌的实验研究[目的]研究表达人IFN-α2b基因的人骨髓间充质干细胞(BMSC-IFN-α)对体外培养的人HepG2和Huh7肝癌细胞的增殖抑制作用；观察BMSC-IFN-α2b移植对裸鼠皮下种植性HepG2肝癌的抑制作用,并探讨可能的分子机制。[方法]1.体外实验1.1 BMSC-IFN-αb及其条件培养基对肝癌细胞活力影响的比较构建人IFN-α2b基因真核重组表达质粒pcDNA3.1-IFN-α2b,利用脂质体介导pcDNA3.1-IFN-α2b重组质粒转染人BMSC,收集BMSC-IFN-α2b及空质粒转染的BMSC的细胞及条件培养基(Conditioned Media, CM)。HepG2和Huh7肝癌细胞分别分为5组：对照组、BMSC共培养组、BMSC-IFN-α2b共培养组、BMSC-CM组和BMSC-IFN-α2b-CM组。对照组HepG2和Huh7肝癌细胞用H-DEME培养；BMSC-CM组HepG2和Huh7肝癌细胞用空质粒转染的BMSC条件培养基培养；BMSC-IFN-α2b-CM组HepG2和Huh7肝癌细胞用BMSC-IFN-αb的条件培养基培养。肝癌细胞培养干预48h,MTT法检测肝癌细胞活力,进行各组间HepG2和Huh7肝癌细胞活力的比较,评价BMSC-IFN-α2b及BMSC-IFN-α-CM对肝癌细胞活力的影响是否具有等效性。1.2 BMSC-IFN-α2b抑制肝癌的体外研究人HepG2和Huh7肝癌细胞分别分为4组：对照组、BMSC-CM组、IFN-α2b组和BMSC-IFN-α2b-CM组。对照组肝癌细胞用H-DEME培养；BMSC-CM组肝癌细胞用空质粒转染的BMSC的条件培养基培养；IFN-α2b组在肝癌细胞培养基中加入重组人IFN-α2b (500IU/ml); BMSC-IFN-α2b-CM组肝癌细胞用BMSC-IFN-a2b的条件培养基培养。各组肝癌细胞分别培养12h、24h和48h,赛唑兰(MTT)比色法检测肝癌细胞活力,免疫荧光染色检测肝癌细胞Brdu阳性率；流式细胞仪分析肝癌细胞周期；Annexin V/PI双染流式细胞仪检测48h的细胞凋亡；qPCR检测肝癌细胞Notch信号通路相关因子Notch1、Hes1和Hes7mRNA的表达；蛋白质印迹技术(Western blot)检测肝癌细胞Notch信号通路相关因子Notch1、Hes1和Hes7蛋白的表达。2.体内实验：BMSC-IFN-α2b抑制肝癌的体内研究用NOD/SCID裸鼠建立皮下种植性HepG2肝癌模型,荷瘤鼠随机分为对照组、BMSC移植组、IFN-α2b治疗组和BMSC-IFN-α2b移植组(n=3)一对照组尾静脉注射100μl PBS溶液;BMSC移植组经尾静脉移植1×107个空质粒转染的BMSC;IFN-α2b治疗组尾静脉注射重组人PEG-IFN-α2b (5×106IU/kg); BMSC-IFN-α2b移植组经尾静脉移植1×107个BMSC-IFN-α2b。BMSC和BMSC-IFN-α2b移植前用DAPI进行标记。观察裸鼠体内肿瘤生长情况,荧光显微镜观察DAPI标记的BMSC和BMSC-IFN-α2b肿瘤内归巢情况。免疫组化染色检测肿瘤组织Ki67和IFN-α2b表达,免疫荧光检测肿瘤组织Notch1表达,Annexin V/PI双染流式细胞仪检测肿瘤组织的细胞凋亡；qPCR检测肿瘤组织中Notch1、Hes1和Hes7基因mRNA的表达；Western blot检测肿瘤组织中Notch1、Hes1和Hes7蛋白的表达。[结果]1.体外实验1.1 BMSC-IFN-α2b及其条件培养基对肝癌细胞活力影响的比较BMSC和BMSC-IFN-α2b分别与HepG2和Huh7肝癌细胞共培养,各组肝癌细胞的活力均显著低于对照组(P=0.000),且BMSC-IFN-α2b组的两种肝癌细胞的活力均显著低于BMSC组(P<0.05); BMSC-CM和BMSC-IFN-α2b-CM培养HepG2和Huh7肝癌细胞后,肝癌细胞的活力均显著低于对照组(P=-0.000),且BMSC-IFN-α2b-CM组的肝癌细胞活力显著低于BMSC-CM组(P<0.05)。而BMSC组和BMSC-CM组肝癌细胞活力比较无显著性差异(P>0.05)；BMSC-IFN-α2b组和BMSC-IFN-α2b-CM组肝癌细胞活力也无显著性差异(P>0.05)。1.2 BMSC-IFN-α2b抑制肝癌的体外研究MTT检测结果发现,各实验组HepG2和Huh7肝癌细胞在培养干预12h、24h和48h的细胞活力均显著低于对照组(P=0.000); BMSC-IFN-α2b-CM组各时间点HepG2和Huh7肝癌细胞的活力均显著低于BMSC-CM组和IFN-α2b组(P<0.01),且BMSC-IFN-α2b-CM组24h细胞活力显著低于12h(P=0.000),48h显著低于24h(P=0.000)。细胞周期分析发现,HepG2和Huh7肝癌细胞干预培养12h, G0/G1期、S期和G2/M期细胞的比例在各实验组间比较无显著性差异(P>0.05)。干预培养24h, IFN-α2b组的HepG2和Huh7肝癌细胞G0/G1期细胞比例显著高于对照组、BMSC-CM组和BMSC-IFN-α2b-CM组(P<0.01),但G2/M期细胞比例显著低于对照组、BMSC-CM组和BMSC-IFN-α2b-CM组(P<0.05)。而Huh7肝癌细胞24h的IFN-α2b组S期细胞比例显著低于对照组、BMSC-CM组和BMSC-IFN-α2b-CM组(P<0.05)。干预培养24h, BMSC-IFN-α2b-CM组Huh7肝癌细胞G2/M期细胞比例显著高于IFN-α2b组和BMSC-CM组(P<0.05)。培养干预48h,对照组HepG2和Huh7肝癌细胞G2/M期细胞比例显著低于BMSC-CM组、IFN-α2b组和BMSC-IFN-α2b-CM组(P<0.05)。AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测48h的肝癌细胞凋亡发现,对照组HepG2和Huh7肝癌细胞早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞比例均显著低于BMSC-CM组、IFN-α2b组和BMSC-IFN-α2b-CM组(P<0.05),且BMSC-IFN-α2b-CM组HepG2和Huh7肝癌细胞的晚期凋亡细胞比例均显著高于IFN-α2b组和BMSC-CM组(P--0.000)。肝癌细胞Brdu免疫荧光染色发现,BMSC-IFN-α2b-CM组HepG2肝癌细胞12h、24h和48h的Brdu荧光阳性率均显著低于对照组、BMSC-CM组和IFN-α2b组(P<0.01),且24h显著低于12h(P=0.002),48h低于24h(P=0.019)。对照组Huh7肝癌细胞12h、24h和48h的Brdu荧光阳性率显著高于BMSC-CM组、IFN-α2b组和BMSC-IFN-α2b-CM组(P<0.05); BMSC-IFN-α2b-CM组24h、48h显著低于BMSC-CM组和IFN-α2b组(P<0.05),且24h显著低于12h(P=0.001),48h显著低于24h(P=0.008)。qPCR基因检测发现,对照组HepG2和Huh7肝癌细胞各时间点Notch1αHes1和Hes7-mRNA的表达均显著高于BMSC-CM组、IFN-α2b组和BMSC-IFN-α2b-CM组(P<0.05)。BMSC-IFN-α2b-CM组HepG2肝癌细胞12h、24h和48h的Notch1、Hes1和Hes7-mRNA的表达均显著低于BMSC-CM组和IFN-α2b组(P=0.000),且24h的Hes1和Hes7-mRNA表达显著低于12h(P=0.000),48h的表达显著低于24h(P=0.000)。BMSC-IFN-α2b-CM组Huh7肝癌细胞各时间点(12h、24h和48h)的Notch1、Hes1和Hes7-mRNA的表达显著低于BMSC-CM组和IFN-α2b组(P=0.000),且12h显著高于24h和48h(P<0.05)。Western blot蛋白检测发现,对照组HepG2和Huh7肝癌细胞各时问点(12h、24h和48h)的Notch1、Hes1和Hes7蛋白的表达均显著高于BMSC-CM组、IFN-α2b组和BMSC-IFN-α2b-CM组(P<0.05)。BMSC-IFN-α2b-CM组HepG2和Huh7肝癌细胞各时间点(12h、24h和48h)的Notch1、Hes1和Hes7蛋白的表达均显著低于BMSC-CM组和IFN-α2b组(P=0.000)。2.体内实验BMSC-IFN-α2b抑制肝癌的体内研究人HepG2肝癌荷瘤鼠分别给予不同的治疗处理后,对照组的肿瘤组织显著重于BMSC组、IFN-α2b组和BMSC-IFN-α2b组(P<0.05),BMSC-IFN-α2b组的肿瘤组织显著轻于BMSC组和IFN-α2b组(P<0.05)。BMSC和BMSC-IFN-α2b组肿瘤组织冰冻切片均可见散在的细胞核发蓝色荧光的DAPI标记细胞,但免疫组化显示,只有BMSC-IFN-α2b移植组可见散在分布的IFN-α2b阳性细胞。对照组肿瘤组织Ki67表达显著高于BMSC组、IFN-α2b组和BMSC-IFN-α2b组(P<0.05),BMSC-IFN-α2b组的表达显著低于BMSC组和IFN-α2b组(P<0.05)。AnnexinV/PI双染流式细胞仪细胞凋亡检测发现,对照组的早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例均显著低于BMSC组(P=0.002)、IFN-α2b组(P=0.000)和BMSC-IFN-α2b组(P=0.000)。晚期凋亡细胞以BMSC-IFN-α2b组最高,显著高于BMSC组和IFN-α2b组(P<0.01)。肿瘤组织Notch1免疫荧光检测发现,对照组Notch1的荧光表达强度显著高于BMSC组、IFN-α2b组和BMSC-IFN-α2b组(P<0.05);BMSC-IFN-α2b组的表达强度显著低于BMSC组和IFN-α2b组(P<0.01)。qPCR基因检测发现,对照组肿瘤组织Notch1、Hes1和Hes7-mRNA的表达均显著高于BMSC组、IFN-α2b组和BMSC-IFN-α2b组(P<0.05),且BMSC-IFN-α2b组Notch1、Hes1和Hes7-mRNA的表达均显著低于BMSC组和IFN-α2b组(P<0.05)。Western blot蛋白表达检测发现,对照组肿瘤组织Notch1和Hes1蛋白的表达显著高于BMSC组、IFN-α2b组和BMSC-IFN-α2b(P<0.05); BMSC-IFN-α2b组Notch1、Hes1和Hes7蛋白的表达均显著低于BMSC组和IFN-α2b组(P<0.05)。[结论]BMSC和IFN-α2b都具有体内外抑制肝癌细胞增殖和诱导凋亡的作用,而IFN-α2b基因修饰的BMSC的抑制作用显著增强,并且是通过对Notch1-Hes1信号通路的抑制来实现。人IFN-α2b基因修饰的BMSC可作为肝癌治疗的工具。