论文部分内容阅读
目的：获得表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的基因工程神经干细胞(Neural stem cells, NSCs),研究缺氧反应元件(hypoxia-reponsive element, HRE)在缺氧条件下是否能提高VEGF基因的表达,以期为缺氧缺血性脑损伤寻求一种安全、高效的基因治疗方法。方法：分离胎龄14天的SD大鼠胚胎前脑皮质,采用无血清培养的方法获得细胞克隆,应用间接免疫荧光法鉴定NSCs和分化的神经细胞。构建携带VEGF165基因的两种重组慢病毒载体pGC-FU-VEGF165,及9HRE-pGC-FU-VEGF165,将两者分别转染NSCs细胞,转染后的NSCs分为7组：A组为转染pGC-FU-VEGF165重组慢病毒后于常氧条件下培养的神经干细胞、B1组为转染9HRE-pGC-FU-VEGF165重组慢病毒后于常氧条件下培养的神经干细胞,B2组为转染9HRE-pGC-FU-VEGF165重组慢病毒后于缺氧条件下培养6h的神经干细胞,B3组为转染9HRE-pGC-FU-VEGF165重组慢病毒后于缺氧条件下培养12h的神经干细胞,B4组为转染9HRE-pGC-FU-VEGF165重组慢病毒后于缺氧条件下培养24h的神经干细胞,C组为转染空载体慢病毒于常氧条件下培养的神经干细胞,D组为未转染慢病毒于常氧条件下培养的神经干细胞作为的空白对照组,(常氧条件为95%02+5%C02；缺氧条件为2%02+98%N2)；荧光显微镜和流式细胞仪检测感染效率,采用RT-PCR法检测转基因NSCs的VEGF基因表达水平,Western-blot及Elisa检测转染后细胞分泌型血管内皮生长蛋白的表达水平,MTT法检测转染后NSCs的增殖活性。结果：①离体培养的胎鼠神经干细胞呈Nestin阳性；②经测序两组目的基因与GenBbank中序列完全一致,成功构建HRE-pGC-FU-VEGF165重组慢病毒、pGC-FU-VEGF165慢病毒载体；③将慢病毒转染至神经干细胞分组后在荧光显微镜下观察可见A组、B2组、B3组、B4组、C组基因工程神经干细胞发出绿色荧光,B1组、D组未见绿色荧光；经流式细胞仪检测A组细胞转染率50%左右,B2组、B3组、B4组、C组细胞转染率为80%左右,B1组、D组细胞转染率为0.49%左右；④RT-PCR检测C组、D组、B1组细胞无明显VEGFmRNA表达,B2组、B3组、B4组、A组细胞均表达VEGFmRNA,B2组、B3组、B4组细胞、/EGFmRNA表达量显著高于A组(P<0.05),且B组内细胞随着缺氧时间延长VEGFmRNA表达量增高(P<0.05)；⑤Western-blot检测C组、D组、B1组无明显VEGF蛋白表达,B2组、B3组、B4组、A组细胞均表达VEGF蛋白,B2组、B3组、B4组细胞VEGF蛋白表达量高于A组(P<0.05),且B组内细胞随着缺氧时间延长VEGF蛋白表达量增高(P<0.05)；⑥Elisa检测C组、D组、B1组无明显分泌型VEGF蛋白表达,B2组、B3组、B4组、A组细胞可表达分泌型VEGF蛋白,B2组、B3组、B4组细胞分泌型VEGF蛋白表达量高于A组(P<0.05),且B组内细胞随着缺氧时间延长分泌型、/EGF蛋白表达量增高(P<0.05)；⑦MTT检测示C组、D组细胞增殖活性无差异(P>0.05),A组、B2组细胞增殖活性均高于与C组、D组(P<0.05),B2组细胞增殖活性高于A组(P<0.05)。结论：成功构建具有缺氧诱导特性的高表达VEGF的基因工程NSCs,证明NSCs-VEGF基因工程干细胞可分泌活性VEGF蛋白,促进神经干细胞增殖,在缺氧时受HRE启动子作用,能提高VEGF基因的表达,随缺氧时间的改变HRE可对VEGF表达水平进行调控,为缺血缺氧性脑损伤实现安全、高效的基因治疗方法提供物质基础。