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根据2006年全国范围内的血清流行病学调查资料,我国1～59岁人群中乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)携带率已从1992年的9.75%降至7.18%,尽管HBsAg携带率降到8%以下,但由于我国人口基数庞大,按目前HBsAg携带率推算,我国仍然有HBsAg携带者约9300万人,约占全世界慢性HBV感染者的1/4。其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)约为2000万～3000万例,全国每年死于乙肝相关肝病约30余万例。所以对慢性HBV感染者特别是对处于非活动性HBsAg携带者(inactive HBsAg carrier,HBsAg-IaC)状态的感染者的管理是一项重要而艰巨的任务。HBV感染者可以打破免疫耐受清除乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B eantigen,HBeAg),产生乙型肝炎病毒e抗体(hepatitis B e antibody,anti-HBe),即发生HBeAg血清学转换,发生HBeAg血清学转换的群体中有67%-80%的人可以保持低水平的HBV DNA或HBV DNA检测不到、ALT水平正常和轻度或不伴有肝组织坏死性炎症的状态,这种被状态定义为HBsAg-IaC状态。HBsAg-IaC状态可以是自发病情缓解而达到,也可以是核苷(酸)类似物(NA)或α干扰素抗病毒治疗达到完全应答后病情得以缓解和稳定而达到,不管HBsAg-IaC状态经历何种过程预后通常较好,是HBV感染者比较理想的维持状态。然而,即使长期保持稳定携带状态,由于肝细胞核内的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)很难被彻底清除,所以当机体处于免疫虚损或免疫抑制状态时或在病毒变异的情况下,病毒就会重新活动、复制,肝组织内再次出现炎症活动。曾有研究报道超过20%的HBsAg-IaCs进展为HBeAg阴性CHB[HBeAg negative chronic hepatitis B,HBeAg(-)CHB],而后者存在肝脏疾病反复活动、进展、发生肝硬化和肝细胞癌的风险,约有23%和4%的HBeAg(-)CHB分别进展为肝硬化和肝癌。为了阻止HBsAg-IaCs向HBeAg(-)CHB发展的进程,首先弄清HBsAg-IaCs和HBeAg(-)CHB宿主和病毒学特征有无差异是很重要的。利用NA对HBeAg阳性慢性乙型肝炎[HBeAgpositive chronic hepatitis B,HBeAg(+)CHB]进行抗病毒治疗,在药物和机体免疫力的共同作用下HBV水平逐渐降低、HBeAg逐渐被清除,其中有相当一部分人可以达到HBsAg-IaC状态,HBeAg(+)CHB经NA治疗达到完全应答的患者(NCR-e+CHB)可以实现并药物维持HBsAg-IaC状态,与自发形成HBsAg-IaC状态的过程不同,为了发现NA抗病毒治疗的疗效与宿主和病毒的关系,认识两组人群的基本特征和各自的病毒学特点也很重要。就以上两个问题我们进行了以下两项临床研究:一.非活动性HBsAg携带者与HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者病毒学特征的比较1.1研究目的:为了探索HBsAg-IaCs向HBeAg(-)CHB进展的危险因素,对自然转归的HBsAg-IaCs和HBeAg(-)CHB两组人群的HBV基因型、PC的G1896和BCP的A1762/G1764变异等病毒学特征分别进行比较。1.2研究方法:按照2005年《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准,进行HBsAg-IaCs和HBeAg(-)CHB患者的血清收集。采用QIAgen blood DNA检测试剂盒(Qiagen,德国)分别对187例HBsAg-IaCs血清、99例HBeAg(-)CHB血清进行HBV DNA提取,然后利用半巢式PCR进行CX片段(nt1643-nt1974)扩增,半巢式PCR的第一轮引物分别为P9和P35,第二轮引物为P9和CSP,用CSP引物作测序引物,使用ABI 3730测序仪(Appliedbiosystems,美国)直接测序。HBV基因组第1762A/1764T以及第1896G核苷酸变异的判断采用Cluster X进行序列排列和人工确认。基因型判断采用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,用PCR-RFLP方法判定不出基因型的标本采用直接测序方法判断(同研究二中基因型确定的方法)。1.3研究结果:187例HBsAg-IaCs组中113例HBsAg-IaCs血清HBV DNA经PCR扩增阳性,其中103份完成CX片段(nt1643-nt1974)测序,HBeAg(-)CHB组中99份血清全部HBV DNA PC扩增阳性,全部完成CX片段(nt1643-nt1974)测序。HBsAg-IaCs组中HBV基因B型比例高于HBeAg(-)CHB组(84/113 vs 46/99,74.3%vs 46.5%,P=0.000);HBsAg-IaCs组的G1896A变异比例高于HBeAg(-)CHB组(69/103 vs 39/99,67.0%vs 39.4%,P=0.000),但A1762T/G1764A变异株比例低于后者(38/103 vs 63/99,36.9%vs 63.6%,P=0.000)。经二分类Logistic回归分析得出男性(OR=7.519,95%CI=2.693-20.995,P=0.000)、年龄超过40岁(OR=25.369,95%CI=5.323-120.913,P=0.000)以及基因C型感染(OR=2.309,95%CI=1.028-5.186,P=0.043)是与HBeAg(-)CHB相关的危险因素的结论,并未发现A1762T/G1764A变异(OR=2.017,95%CI=0.958-4.247,P=0.065)与G1896A变异(OR=0.565,95%CI=0.265-1.205,P=0.140)有明显的独立预测HBeAg(-)CHB的作用。1.4研究结论:HBsAg-IaC在病毒学特征上与HBeAg(-)CHB明显不同;HBV基因C型(HBV/C)感染、年龄大的男性HBsAg-IaCs相对容易向HBeAg(-)CHB发展。二.NA治疗HBeAg(+)CHB完全应答患者的病毒学特点2.1研究目的:为了认识NCR-e+CHB和HBsAg-IaC两组人群HBsAg-IaC状态的稳定性的差异、影响NA疗效的因素,对NCR-e+CHB和HBsAg-IaC两组人群的宿主基本特征及HBV的基因型、PC的G1896A和BCP的A1762T/G1764A变异等病毒学特征方面进行比较。2.2研究方法:首先按照2005年《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准,收集NCR-e+CHB(治疗组)和HBsAg-IaCs(对照组)的血清收集。采用QIAgen bloodDNA检测试剂盒(Qiagen,德国)分别对117例NCR-e+CHB和58例HBsAg-IaCs进行HBV DNA提取,然后以BS1和POL2为外引物、YS1和YS2为内引物行巢式PCR对S区进行扩增,对HBV DNA S区扩增阳性的标本的PCR产物利用RFLP法进行内切酶酶切、电泳、观察条带基因分型,基因分型不明确的再进行测序鉴定基因型。再利用巢式PCR对117例NCR-e+CHB和58例HBsAg-IaCs进行PC和BCP区两个片段的扩增:以P9、CSP为第一轮引物,再分别以P9、P11和Ce、CSP为第二轮引物,共用第一轮PCR产物进行BCP和PC区两个片段的PCR扩增,再利用错配PCR-RFLP方法对扩增阳性的标本的第二轮PCR产物进行酶切确定变异情况,不能酶切的标本再行研究一所述的半巢式PCR对CX片段(nt1643-nt1974)进行扩增,对CX片段(nt1643-nt1974)阳性的PCR产物进行直接测序,测序结果采用Cluster X进行序列排列和人工确认以对G1896A和A1762T/G1764A进行检测。2.3研究结果:NCR-e+CHB组男性比例高于HBsAg-IaC组(77.8%vs 58.6%,P=0.008),NCR-e+CHB组的平均年龄大于HBsAg-IaC组(t=2.2.67,P=0.025),NCR-e+CHB组中血清HBV DNA S区扩增阳性率低于HBsAg-IaC组中血清HBV DNA S区扩增阳性率(52.1%vs 79.3%,P=0.001),经PCR-RFLP和测序的方法分析得出NCR-e+CHB组中1例A型、44例B型、16例C型,HBsAg-IaC组中33例B型、10例C型、2例D型、1例基因型不明,两组的主要基因型构成比无统计学差异(χ~2=0.154,P=0.694);使用酶切和部分PCR产物直接测序的方法总计得出:NCR-e+CHB组BCP区A1762T/G1764A检出率显著低于HBsAg-IaC组(9.8%vs 41.4%,P=0.002),PC区G1896A检出率亦明显低于HBsAg-IaC组(14.0%vs 72.4%,P=0.000)。2.4研究结论:NCR-e+CHB人群的潜在病毒水平较HBsAg-IaC的低。两组人群中感染的主要HBV基因型构成比没有明显差异,都是以B基因型为主。NCR-e+CHB患者G1896A和A1762T/G1764A变异检出率分别低于HBsAg-IaC的以上两区域的变异检出率。