柑桔黄龙病(Huanglongbing,HLB)是影响全球柑桔产业的一种毁灭性病害,会造成柑桔叶片斑驳、黄化,导致柑桔减产直至植株死亡。该病原菌至今未能得到稳定的纯培养,因此对其防治方法也受到极大的限制,目前尚未有有效的杀菌制剂,一旦发现病株就只能通过铲除并焚烧病树的方法来阻止黄龙病的传染。利用抗病品种具有的某些特性来提高植物抗病性是植物病害防治的重要措施。柑橘黄龙病菌的寄主包括芸香科的多种植物和其他科属的植物,然而不同的植物种类对病害的感病性有着明显的差异,因此利用感病性弱甚至是有耐病特征的植物分离其中抗病相关的基因进行抗病育种,对于黄龙病这一类危害极大、防治困难的病害尤其具有重要意义。进行抗病育种研究首先需要具有抗病种质资源或抗病基因,现有的柑桔品种中具有抗病特征的资源十分有限,从亲缘关系较近的植物属或科中得到相应的抗病相关基因是进行抗病育种的可行办法。随着分子生物学技术的不断发展,已通过图位克隆法、转座子标签法等方法分离鉴定到一些植物抗性基因,本研究的目的即是从抗(耐)柑桔黄龙芸香科植物中克隆抗病基因同源序列,为柑桔黄龙病的抗病育种提供一些基础材料。本论文的研究内容包括:(1)根据已知植物抗性基因表达产物的保守区域核苷酸结合位点(nucleotide binding site,NBS)设计简并引物,以田间对黄龙病具有耐病特征的芸香科寄主植物九里香和柚的基因组DNA为模板,PCR扩增其抗病基因同源序列(Resistance gene analogs, RGAs),并对获得的序列进行生物信息学分析,揭示不同寄主植物抗病基因的多样性及进化关系;(2)以耐黄龙病的柑桔属植物柚的cDNA为模板,PCR扩增RGAs,进行克隆测序,根据测序结果设计特异性引物,通过实时荧光定量PCR对RGA在甜橙嫁接HLB后的连续八次采样中的表达进行实时定量分析。主要的研究结果有:根据已知植物抗性基因蛋白NBS保守结构域引用设计的5条简并引物,随机组合成六对引物以九里香和柚的基因组DNA为模板进行PCR扩增,通过RFLP分析和克隆测序,共获得43个抗性基因同源序列(Resistance gene analogs,RGAs)。NCBI序列比对结果显示43个片段与已有报道的抗性基因及已克隆的抗性基因同源序列具有不同程度的同源性,其中有12个RGAs能翻译成完整连续的氨基酸序列。通过Clustalx、DNAMAN等软件分析RGAs及其推导的氨基酸的同源性,结果显示它们都包含NBS-LRR类抗性基因所具有的保守区域:P-loop、Kinase-2a、GLPLAL,其与已克隆的烟草N、亚麻L6、拟南RPS2、RPS5、RPP8、RPM1等多种抗病基因在保守区域氨基酸水平上的同源性为37.39%-43.43%,可望进一步用于HLB抗病基因的分子筛选及遗传图谱的构建。以柚的cDNA为模板进行PCR扩增,RFLP分析后选取6个差异片段送去测序,经测序后通过DNAMAN等软件对序列进行分析后发现,其中有5个片段属于NBS类RGAs,比对结果显示其与7个已知植物R基因的保守结构域相应氨基酸序列同源性为19.71%-42.86%。此外,实验中得到的5条RGAs中,kinase-2a最后一个氨基酸皆为色氨酸,属于non-TIR-NBS-LRR类。对甜橙进行嫁接黄龙病菌的处理后利用实时荧光定量PCR对5个RGAs在HLB侵染过程中的表达进行研究观察,结果显示嫁接黄龙病病芽后的八次采样中5个RGA的表达都有不同程度的变化,初步断定与黄龙病的侵染相关。其中,GJ20和GJ31在实验组第2次采样中表达量大幅上升,而在嫁接病原前后其余月份的表达变化幅度较小,相对比较稳定;GJ28在实验组第4次采样时表达上调,其余几个月表达趋于稳定; GJ10在嫁接病原后3个月时表达下降,其余月份与对照组几乎达到平衡; GJ35在嫁接病原后总体表达较对照组大幅度下调。根据表达情况,进一步推测GJ20和GJ31较有可能与HLB菌的相关抗性基因相关。现有研究证明RGA在植物基因组中广泛存在,本研究中得到的序列为果树抗病育种提供了潜在的应用价值。同时,通过病原诱导后RGA的表达情况的研究为HLB相关基因的克隆奠定了一定的基础。