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研究背景：癫痫发作,尤其是癫痫持续状态(status epilepticus, SE)可造成脑组织,特别是海马组织广泛性损伤,但其确切机制尚未完全阐明。研究表明癫痫发作后产生的脑部炎症反应参与了癫痫的发生和发展,并对神经元的损伤起着重要作用,核转录因子-κB (NF-κB)是炎性反应的核心环节,癫痫脑内存在NF-κB的异常激活。我们前期研究证实：抑制NF-κB能明显减轻癫痫所致的神经元损伤,起到脑保护作用,但具体调控机制目前尚不明确。癫痫频繁发作常伴随着大脑缺氧,且海马区域尤为突出。低氧诱导因子-1α (HIF-1α)是哺乳动物和人体内广泛存在的一类核转录因子,HIF-1α作为低氧的标志在癫痫脑组织中表达显著增加,但过表达的HIF-1α对神经元起到保护作用还是损害作用?目前尚不清楚。肿瘤和消化系统的研究中均发现,HIF-1α表达受NF-κB的调控,NF-κB是HIF-1α活化所必需的转录因子,抑制NF-κB/HIF-1α通路的活化能抑制肿瘤的生长和减轻肠道屏障功能紊乱。那么,癫痫病理过程中,NF-κB是否通过调控HIF-1α导致癫痫发作后神经元的损害?抑制NF-κB/HIF-1α通路的激活能否减轻癫痫后的脑损伤?目前国内外未见相关报道。本研究拟通过体内实验,探讨NF-κB、HIF-1α在SE癫痫大鼠海马神经元损伤中的作用及相互关系,以期进一步阐明癫痫发作后脑损伤的机制。第一部分HIF-1α的过表达对癫痫持续状态大鼠海马神经元损伤的影响目的：探讨HIF-1α对大鼠癫痫持续状态后海马神经元损伤的影响。方法：选择125只成年雄性SD大鼠,随机分成4组：生理盐水对照组(Control, n=25)、SE模型组(SE,n=50)、二甲基亚砜(DMSO, HIF-la的溶解剂)假性治疗组(SE+DMSO, n=25)、HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇(2ME2)治疗组(SE+2ME2, n=25),其中SE组根据观察时间分为6h、12h、24h、48h、72h。采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射法制作SE模型,SE+2ME2组大鼠在注射匹罗卡品前15mmin,给予15mg/kg 2ME2腹腔注射1次,SE+DMSO组大鼠在注射匹罗卡品前15min,给予等量DMSO腹腔注射1次,SE+2ME2组和SE+DMSO组大鼠于癫痫发作后24h处死。观察各组大鼠癫痫发作情况；采用Western blotting检测海马中HIF-1α和活化的半胱氨酸门冬氨酸特异性蛋白酶3 (cleaved caspase-3)凋亡蛋白的表达水平；采用免疫组织化学法检测海马HIF-1α和cleaved caspase-3蛋白表达部位和表达变化；采用Fluoro-Jade C (FJC)染色法评估海马神经元损害情况。结果：SE组、SE+DMSO组和SE+2ME2组大鼠造模成功率(90%、88%、92%;P>0.05)；发作严重导致的死亡率(33%、36%、30%；P>0.05)；初次到达Ⅳ级发作时间(SOT4) (32.36±10.05、33.95±9.668、34.87±11.28; P>0.05)和初次达到V级时间(SOT5) (40.80±9.855、41.73±10.34.43.17±10.40; P>0.05)差异均无统计学意义；Western blotting检测显示,和生理盐水对照组相比(0.151±0.083,0.060±0.017),海马HIF-1α和cleaved caspase-3从癫痫发作6h、12h、24h、48h和72h后蛋白表达(0.337±0.116,0.180±0.045；0.701±0.168,0.195±0.037；1.017±0.080,0.284±0.0535；0.646±0.114,0.240±0.051；0.370±0.063,0.181±0.037)均增加(P<0.05),其中HIF-1α在24h表达最高,cleaved caspase-3在6h到72h间表达均处在较高水平；和SE24h亚组相比,SE+2ME2组大鼠海马内HIF-1α蛋白(0.259±0.071)表达经2ME2处理后降低(P<0.05),其下游cleaved caspase-3蛋白(0.210±0.051)表达也同样降低(P<0.05)；免疫组织化学染色显示SE+2ME2组大鼠海马CA1和CA3区HIF-1α (64535±16278, 114860±25150)和cleaved caspase-3 (38360±5173,58596±19940)染色的累计光密度值(IOD)均比SE 24h亚组(201658±40978,339091±24972;87308±14710,48662±27198)下降(P<0.05)；FJC神经元变性染色发现：SE+2ME2组大鼠海马CA1区(43.330±5.508)和CA3区(36.67±6.028)变性神经元数目比SE24h亚组(95.33±11.68,88.67±7.767)减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：癫痫大鼠海马HIF-1α的表达增加,抑制HIF-1α表达能通过减少凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达,减少海马神经元死亡,发挥脑保护作用。第二部分NF-κB通过上调HIF-1α促进癫痫持续状态大鼠海马神经元损伤目的：探讨NF-κB/HIF-1α在癫痫持续状态(status epilepticus, SE)大鼠海马神经元损伤中的调控作用。方法：选择110只成年雄性SD大鼠,随机分成7组：生理盐水对照组(Control, n=15)、假手术组(Sham, n=15)、 SE模型组(SE, n=20)、NF-κB特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)组(n=15)、SE+PDTC干预组(SE+PDTC, n=15)、SE+HIF-la siRNA侧脑室注射干预组(SE+HIF-la siRNA, n=15)、 SE+Control siRNA侧脑室注射假性干预组(SE+Control siRNA, n=15)。采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射法制作SE模型,观察大鼠癫痫发作情况,造模后24 h采用蛋白免疫印迹分析检测海马中NF-κB p65和HIF-la的表达水平；采用Fluoro-Jade C (FJC)染色法检测海马退行性变神经元。结果：SE后24 h,海马NF-κB p65和HIF-1α核蛋白含量(0.57±0.06、0.47±0.07)比 Control组(0.23±0.03、0.20±0.03)增高,差异均有统计学意义(P<0.05)；PDTC干预后,海马核蛋白NF-κB p65和HIF-1α含量(0.23±0.03、0.14±0.03)比SE组降低,CA1区FJC阳性细胞(28.33±5.03)比SE组(76.67±13.32)也减少,差异均有统计学意义(P<0.05)；SE大鼠侧脑室注射HIF-1α siRNA后,海马HIF-1α全蛋白含量(0.22±0.03)比SE组(0.39±0.06)降低,CA1区FJC阳性细胞(27.34±7.02)比SE组(76.67±13.32)也减少,差异也均有统计学意义(P<0.05)。结论：癫痫发作可导致脑内NF-κB/HIF-1α通路活化,抑制NF-κB/HIF-1α通路的活化能减轻SE所致的海马神经元损伤,具有脑保护作用。