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前言: 脓毒症(Sepsis)和感染性休克(Septic Shock)具有极高的发病率和病死率,已经成为现代医学所面对的一项重要挑战。严重感染导致的全身炎症反应综合症(Systemic Inflammatory Response Syndrome,SIRS)被认为是脓毒症的核心机制,但是对疾病发生、发展具体的病理生理机制仍然了解有限。肺脏和肠道在发生脓毒症时极易受到损伤,损伤后释放的炎症介质、细胞因子既可以继续损伤肺组织、肠道粘膜和其他组织器官,又进一步加重了SIRS,形成恶性循环,最终导致了全身多脏器功能不全(Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS)的发生。 盲肠结扎穿孔(Cecal Ligation And Puncture,CLP)被认为是目前动物实验研究中脓毒症模型的金标准,盲肠穿孔后导致细菌性腹膜炎,继发SIRS、感染性休克、MODS。所以本次实验选择CLP制备腹膜炎脓毒症模型进行研究。 短链脂肪酸(Short Chain Fatty Acids,SCFA)包括乙酸、丙酸和丁酸(Butyrate),是膳食纤维在肠道内被厌氧菌分解产生的有机酸。SCFA中对肠道功能影响最大是丁酸。丁酸具有促进水电解质吸收、快速为肠道细胞提供能量、增强肠道上皮屏障等功能。丁酸在以前的研究中已经被证实可以减轻脓毒症对肺、肝、肾的损伤。但是丁酸对脓毒症肠道损伤的保护作用研究未有报道,并且本次实验选择了经肠道给药,肠道给药与丁酸生理性的生成更加相似,临床应用前景更大,所以设计了本次实验进行研究。 方法: 一、动物及模型制备 SpragueDawley(SD)雄性大鼠共32只体重为230-260克。实验开始之前给予大鼠无膳食纤维饮食7天进行肠道内无丁酸洗脱,以尽量减少肠道内残留丁酸对实验的影响。 大鼠麻醉选择10%水合氯醛腹腔注射(0.3ml/100g)。注射10分钟达到麻醉深度后开始实施CLP模型:首先腹部备皮消毒后切开2cm切口,找到盲肠、暴露,在盲肠远端1/2用4号丝线紧紧结扎,并应用无菌7号针头在已结扎盲肠远端中央处贯通穿刺2次。通过盲肠向近端寻找回肠,找到回肠末端,在回肠末端距回盲瓣10cm处做预荷包缝线,于荷包正中用探子戳一直径约0.3x0.3cm小洞,将内径2毫米软管置入盲肠内2cm,收紧荷包线,打结并固定软管,然后把手术后盲肠和回肠还纳回腹腔,肌肉及皮肤逐层丝线缝合,最后再次缝合线缠绕固定留置导管。所有的大鼠术后皮下注射生理盐水(4ml/100g)液体复苏预防休克。 二、实验分组及干预 经过7天的无膳食纤维洗脱期后32只SD大鼠被随机分成4组(每组8只):对照组(CON),大鼠麻醉后开腹回肠末端置入导管,不进行CLP术,关腹后给予置入导管内1.5毫升/小时持续泵注生理盐水。丁酸对照组(SB),手术过程与对照组相同,置入导管内1.5毫升/小时持续泵注浓度为15mmol/L丁酸钠(SB)。脓毒症组(CLP),给予CLP手术及回肠末端置管,关腹后导管内1.5毫升/小时持续泵注生理盐水。丁酸实验组(CLP+SB),给予CLP手术及回肠末端置管,关腹后导管内1.5毫升/小时持续泵注浓度为15mmol/LSB。术后所有大鼠继续自由无膳食纤维饮食、饮水。手术结束后24小时,所有大鼠再次麻醉后开腹穿刺腹主动脉取血3毫升检测细胞因子,距离回盲瓣5cm处截取回肠2cm用于组织病理学检查。之后打开胸腔截取肺组织,左肺上叶用于组织病理学检查,左肺下叶用于髓过氧化物酶(MPO)检测,右肺用于肺湿重干重比值(W/D)计算。最后所有大鼠斩首处死。血液标本经过3000转4℃离心5分钟后取得血清标本,储存在-70℃冰箱备用。 三、组织病理学检查 所有大鼠的肺和肠标本固定于10%甲醛溶液中,然后石蜡包埋、切片,HE染色光镜下观察组织受损及炎症细胞浸润情况。 四、肺MPO检测及组织W/D测定 取大鼠左肺组织制备匀浆液取上清液检测。按照MPO检测试剂盒说明书力法操作,在460nm处测吸光度,根据标准品计算MPO活性。大鼠右肺标本用滤纸吸去表面液体后称重,然后置于60℃烤箱内加热72小时再称重,计算肺标本W/D。 五、D-乳酸,二胺氧化酶(DAO)与细胞因子的检测 四项血清检测均应用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)检测,按照试剂盒说明书依次加入样本、标准品、抗体、工作液、显色剂,最后加入终止液应用酶标仪检测吸光度,最终根据标准曲线计算样本D-乳酸、DAO、TNF-α和IL-6的浓度。 六、统计学分析 所有数据以Mean±SD表示,组间差异采用单因素方差分析(one-wayANOVA)进行比较。统计数据应用SPSS17.0软件进行统计计算,P<0.05被认为具有统计学意义。 结果: 一、SB对CLP脓毒症大鼠肺脏损伤的影响 CLP脓毒症模型导致MPO活性及W/D明显升高,但持续SB肠道灌注的CLP+SB组MPO活性及W/D明显低与CLP组(P<0.05)。组织病理学上CON和SB组无明显异常,CLP组肺泡内出现大量渗出,炎症细胞浸润,而CLP+SB组肺泡内出现了渗出和炎症细胞浸润,但程度明显较CLP组减轻。 二、SB对CLP脓毒症大鼠肠道损伤的影响 与CON组和SB组相比,CLP组与CLP+SB组血清D-乳酸和DAO明显升高,但CLP+SB组升高水平明显低于CLP组(P<0.05)。在组织学观察上CON组和SB组基本无损伤改变,CLP组肠道出现炎症细胞浸润、溃疡、肠粘膜绒毛被破坏、失去完整性。CLP+SB组同样出现炎症细胞浸润、溃疡等损伤改变,但损伤程度较CLP组明显减轻,肠粘膜绒毛完整性基本保存。 三、SB对全身炎症反应的影响 CLP明显导致血清TNF-α和IL-6水平升高,但与CLP组相比,肠道持续灌注SB可以使SB+CLP组TNF-α和IL-6水平明显减低(P<0.05)。 结论: 对于CLP腹膜炎脓毒症模型大鼠给予回肠末端持续灌注丁酸可以减轻全身炎症反应,保护肠道与肺脏,减轻损伤。