研究背景和目的：结直肠癌是全世界主要恶性肿瘤之一,同时也是引起肿瘤患者死亡的主要原因之一。转移是导致结直肠癌患者死亡的重要原因,文献报道有一半以上的结直肠癌患者在行根治性手术前、术中已出现了不同程度微转移,而微转移是结直肠癌术后转移和复发的直接原因。结肠癌早期远处转移的原发机制可能与EMT密切相关,EMT是一个复杂的过程,其重要特征是失去极向的上皮细胞获得间质细胞的特性。肿瘤细胞通过EMT获得侵袭性表型远离原发的肿瘤块,侵入间质周围并且迁移到远处。越来越多的临床和实验均证实EMT在结直肠癌播散中发挥重要作用。TGF-β是上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)过程的重要诱导因素之一,肿瘤细胞的EMT与肿瘤转移密切相关,能使没有侵袭和迁移能力的细胞获得浸润能力并最终转移到其它组织和器官,从而使得肿瘤形成远处转移,并再次通过间质上皮转化(Mesenchymal-epithelial transition, MET)定植形成转移灶。因此,阐明EMT与结直肠癌转移的分子机制,对结直肠癌转移进行预测、诊断和预后判断,具有重要意义。L1M和SH3蛋白1(LIM and SH3 protein, LASP-1)是课题组前期研究筛选并鉴定的结直肠癌转移相关蛋白。LASP-1 cDNA(No.X82456)最初是从乳腺癌转移性淋巴结(metastatic axillary lymph nodes,MLN) cDNA文库中筛选克隆得到[8],其mRNA全长约4000个核苷酸,所编码蛋白由261个氨基酸组成,在它的氨基末端含有LIM(Lin-11,Isl-1 and Mec-3)功能域,羧基末端包含一个Src同源结构域3(Src homology 3,SH3),研究报道LASP1蛋白与肿瘤转移侵袭密切相关。为探究LASP-1参与结直肠癌转移的机制,我们前期采用高通量的双向荧光差异凝胶电泳技术(2-DDIGE)筛选LASP-1相关蛋白,成功筛选并鉴定了S100蛋白家族成员之一S100A11。S100钙结合蛋白All (S100calcium binding protein A11, S100A11)是S100家族重要成员之一,又被称为S100钙结合蛋白C(S100 calcium binding protein C, S100C)、钙平衡素(calgizzarin)、淋巴结转移基因蛋白70(metastatic lymph node gene 70protein, MLN70)等,于1991年首次在鸡砂囊平滑肌细胞中被发现。S100A11在很多肿瘤中均已报道,且对肿瘤细胞的调节具有双向性。与其他S100家族蛋白不同,S100A11可分布于细胞核中,提示其具有潜在的转录调控能力。当环境中Ca2+和TGFP浓度升高时,S100A11与核仁蛋白结合,易位到细胞核中参与调控正常人角蛋白细胞(NHK)生长。正常人成纤维细胞中,S100A11位于细胞质中,但成纤维细胞生长发生变异时,可以在细胞核内发现S100A11,提示TGFβ参与S100A11调控。有文献报道经典的TGFβ/Smad信号通路是结直肠癌患者治疗的新靶点。还有文献指出,TGFβ可通过促进LASP1过表达进而激活Smad信号通路诱导经典的EMT进程。本课题拟通过分子病理及分子生物学方法,结合体内外研究,全方位阐明S100A11促进结直肠癌转移发生的作用,提供LASP1调控S100A11发挥生物学功能的直接证据,多方面实验论证了经典的TGFβ/Smad信号通路通过LASP1-S100A11轴诱导结直肠癌转移,为确立TGFβ-LASP1-S100A11轴作为晚期结直肠癌患者临床治疗靶点提供充分的科学依据。方法：1、分析结直肠癌组织中LASP1和S100A1 l表达的相关性,细胞内导入外源性LASP1后检测S100A11蛋白及mRNA的表达,激光免疫共聚焦、免疫共沉淀等方法检测LASP1与S100A11蛋白水平的相互作用；2、TGFβ处理细胞从形态学及分子表型观察其诱导EMT发生,检测下游蛋白LASP1、S100A11的表达及Smad信号通路的激活,沉默LASP1、S100A11的表达,探讨其在TGFβ介导EMT过程中的关键作用；3、免疫组织化学检测临床结直肠癌组织样本(含完整临床及随访资料)中S100A11的表达,冰冻切片免疫荧光观察S100A11亚细胞定位,分析S100A11不同的亚细胞定位表达与临床病理学参数及预后的关系；4、引入核定位和核输出信号改造S100A11重组载体,构建不同亚细胞定位的过表达S100A11细胞系,RNA干扰技术沉默S100A11的表达,从体外水平观察结直肠癌细胞生物学行为的影响,探讨其在EMT发生过程中的作用；5、构建不同亚细胞定位的稳定过表达S100A1 1细胞系,免疫印迹和免疫荧光鉴定稳定株构建成功,从体内外水平观察结直肠癌细胞生物学行为的影响,探讨其在EMT发生过程中的作用；6、利用免疫共沉淀联合质谱鉴定技术,筛选并构建S100A11胞浆内相互作用的信号分子及在细胞核内相互作用的转录调控因子,合成特异性siRNA,探讨其对肿瘤生物学行为及信号通路的作用,敲除候选靶蛋白的表达分析其在TGFβ-LASP1-S100A11介导的生物学功能中的作用,明确S100A11胞浆和胞核水平的双重调控机制在肿瘤恶性生物学行为中的作用；统计学分析：使用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析(SPSS Chicago, USA),定量数据为3次独立实验结果汇总用均数±标准误表示。两组间数据的比较使用独立样本T检验,多组间数据的比较使用One-way ANOVA。CCK8数据用析因设计资料的方差分析。S100A11与临床病理学参数之间关系用Pearson’s chi-squared (χ2)检验；Kaplan-Meier生存曲线用来统计S100A11单因素变量预后相关分析,多因素变量分析用Cox比例风险回归。P<0.05为差异具有统计学意义。结果：1. LASP1在蛋白水平通过蛋白质相互作用正向调节S100Al1的表达1.1 LASP1正向调节S100Al1蛋白水平的表达为验证前期蛋白质组学筛选的结果,在细胞水平,将结直肠癌细胞系SW480和HCT116中导入LASP1cDNA, siRNA介导的RNA干扰SW620和HCT116中LASP1的表达,通过实时荧光定量PCR、Western Blot和免疫荧光共聚焦分别检测S100A11 mRNA或蛋白水平的表达。PCR结果显示LASP1不影响S100A11 mRNA表达水平(P>0.05)、Western Blot显示LASP1调节S100A11蛋白水平表达、免疫荧光共聚焦发现LASP1与S100A11蛋白水平表达正相关,并存在共定位情况；在组织学水平,利用免疫组织化学方法检测50例石蜡包埋组织中LASP1和S100A11蛋白的表达,统计学分析二者表达正相关关系(R=0.445,P=0.004)。1.2分析LASP1和S100Al1的相互作用鉴于前者免疫荧光共聚焦结果,我们再次利用COIP实验正向反向验证SW620、HCT116细胞中LASP1与S100A11结合情况,结果显示：LASP1与S100A11存在结合作用。2. LASP1通过S100A11介导结直肠癌细胞的侵袭性表型和EMT2.1 LASP1通过S100A11介导结直肠癌细胞的侵袭性表型为了检测S100A11在LASP1介导的细胞侵袭性表型的变化,我们进行了恢复实验。首先分别设立BLANK、NC、ASP1、LASP1+si-S100A11组;BLANK、 NC、si-LASP1、si-LASP 1+S100A11组,用Transwell实验验证S100A11对LASP1介导的细胞迁移能力的影响。我们发现SW480、HCT116细胞中同时过表达LASP1和敲低S100A11后可明显抵消细胞中LASP1介导的迁移能力(P<0.05),而同时干扰LASP1和过表达S100A1l后可明显恢复细胞的迁移能力(P<0.05)。2.2 LASP1通过S100All介导结直肠癌细胞的EMT为了检测S100A11在LASP1介导的细胞EMT的变化,我们进行了恢复实验。我们首先分别设立BLANK、NC、LASP1、LASP1+si-S100A11组;BLANK、 NC、si-LASP1、si-LASP1+S100A11组,用Western Blot实验验证细胞EMT变化。我们发现SW480、HCT116细胞中共转染LASP1cDNA3.0和si-S100A11后可明显逆转结直肠癌细胞中LASP1诱导的EMT,即EMT间质指标FN表达减少,上皮指标E-cadherin增高；与此相反,共转染si-LASP1和S100A11质粒后可明显抑制结直肠癌细胞发生EMT,即EMT间质指标FN表达增多,上皮指标E-cadherin减弱。2.3 S100All参与TGFβ介导的EMT发生为了阐明S100A11与TGFβ信号关系,我们首先用TGFP刺激SW480、 HCT116细胞,分别刺激0h、24h、48h,发现S100A11可促进结直肠癌细胞发生EMT。而用TGFβ受体抑制剂SB431542处理后,EMT现象减弱。恢复实验同样说明了此现象。3.胞浆胞核中S100All在结直肠癌中的表达及其临床意义3.1结直肠癌组织中S100Al1的表达1HC实验表明S100A11阳性表达主要定位于细胞质和细胞核中,肿瘤组织中S100A11蛋白表达水平高于相配对的正常结直肠组织。Western Blot实验结果同样显示肿瘤组织中的S100A11蛋白表达水平高于相配对的正常结直肠组织(P<0.05),组织免疫荧光结果显示S100A11蛋白在癌旁正常组织中的表达水平较低,在癌组织中表达水平较高,细胞浆与细胞核中均有表达。3.2结直肠癌细胞中S100A11的表达Western Blot结果显示人结直肠癌细胞株中S100A11蛋白均有表达,且在同一亲本来源、转移潜能逐渐增高SW480,SW620, SW480/M5细胞中表达水平依次递增,提示其可能与结直肠癌的转移有关：免疫荧光结果显示,S100A11主要定位于胞浆,其中SW480.SW620、SW480/M5和RKO细胞S100A11定位于细胞浆及细胞核。3.3 S100A11的表达水平与患者临床预后的相关性分析Kaplan-Meier生存分析结果显示,核、浆中S100A11过表达的结直肠癌患者总体生存率显著低于低表达组,统计学上有显著差异(P<0.05)。3.4影响CRC患者预后的单因素与多因素分析单因素分析提示核、浆中S100A11过表达与结直肠癌患者临床预后相关,然而,目前多因素逐步回归分析的研究结果尚不支持将胞浆、胞核S100A11过表达作为预测患者不良预后的独立指标(P>0.05)。4.体外胞浆胞核中分别过表达S100A11促进结直肠癌细胞的侵袭性表型并诱导EMT4.1瞬时过表达S100A11对结直肠癌细胞增殖迁移和划痕愈合能力的影响①S100A11瞬时过表达效果验证引入核定位、核输出信号,构建了S100A11胞浆、胞核亚细胞定位表达载体(HA-NLS-S100A11、HA-NES-S100A11、HA-S100A11)及空白对照组载体(HA),瞬时转染内源性低表达S100A11的SW480、HCT116细胞,Western Blot检测外源性HA-S100A11融合蛋白和内源性S100A11蛋白表达。结果表明转染HA-S100A11-、HA-NES-S10A11-、HA-NLS-S100A11-质粒后,相对于HA-对照组,外源性HA-S100A11融合蛋白和内源性S100A11蛋白表达均明显增高。②S100A11瞬时过表达对结直肠癌细胞增殖能力的影响CCK8实验结果显示,在SW480和HCT116细胞中,瞬时过表达S100A11的细胞(HA-NLS-S100A11-、HA-NES-S100A11-、HA-S100A11-)与对照组(HA)相比生长速度显著上升,差异具有统计学意义(SW480,P<0.05;HCT116,P<0.05).结果表明,体外过表达S100A11能够促进结直肠癌细胞的增殖。③S100A11瞬时过表达对结直肠癌细胞迁移能力的影响Transwell细胞迁移实验结果显示,在SW480和HCT116细胞中,瞬时过表达S100A11的细胞株(HA-S100A11-、HA-NLS-S100A11-、 HA-NES-S100A11-)与对照组(HA)相比细胞迁移的数量明显增多(P<0.05)。④S100A11瞬时过表达对结直肠癌细胞划痕愈合能力的影响划痕实验结果显示,瞬时过表达S100A11的细胞株(HA-S100A11-、 HA-NLS-S100A11-、HA-NES-S100A11-)与对照组(HA)相比迁移率明显增加(P<0.05)。上述实验结果表明,过表达S100A11在体外能够促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和划痕愈合能力。4.2 S100Al1瞬时沉默对结直肠癌细胞增殖和侵袭,划痕愈合能力的影响①S100A11瞬时沉默效率验证将阴性对照末端用带绿色荧光的荧光标记物进行转染效率评价结果显示：siRNAoligo的转染效率可达60%-70%,具有较高的转染效率,便于达到较好的基因沉默效果；将siRNA-192,siRNA-257片段分别转染内源性高表达S100A11的HCT116细胞和SW480/M5细胞,Western Blot结果显示：转染siRNA-192片段干扰的细胞S100A11蛋白表达水平明显下降,表明siRNA-192干扰片段可以明显敲低S100A11的表达。②S100A11瞬时沉默对结直肠癌细胞增殖能力的影响CCK8实验结果显示：在HCT116细胞和M5细胞中,S100A11干扰组(siRNA-192)的生长速度显著慢于对照组(NC),组别与时间存在交互效应,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明,S100A11的沉默在体外能够抑制结直肠癌细胞的增殖。③S100A11瞬时沉默对结直肠癌细胞迁移能力的影响Transwell细胞迁移实验结果显示：在HCT116细胞和M5细胞中,瞬时干扰S100A11(siRNA-192)后,细胞的迁移数目显著少于对照组(NC)(P<0.05)。结果表明,S100A11的沉默在体外能够抑制结直肠癌细胞的迁移。④S100A11瞬时沉默对结直肠癌细胞划痕愈合能力的影响划痕实验结果显示：在HCT116细胞和M5细胞中,S1OOA11瞬时干扰(siRNA-192)组相比对照组(NC)愈合能力明显减弱(P<0.05)。结果表明,S100A11的沉默在体外能够抑制结直肠癌细胞的增殖迁移划痕愈合能力。4.3 S100Al1调控结直肠癌转移的分子机制为了探讨S1OOA11过表达后对CRC细胞株EMT相关分子标志物的影响,Western Blot检测SW480、HCT116两种结直肠癌细胞瞬时转染HA、HA-S100A11-、HA-NLS-S100A11、HA-NES-S100A11-四个质粒后,EMT相关分子标志物的变化。结果显示：SW480和HCT116细胞HA-S100A11-、 HA-NLS-S100A11-、HA-NES-S100A11-三个处理组上皮标志物(E-cadherin)的表达较HA对照组表达量低；HA-S100A11-、HA-NLS-S100A11-、 HA-NES-S100A11-三个处理组间质标志物(Vimentin、Fibronectin).转录因子slug的表达较HA-对照组表达量高,且处理组中p-smad2.p-smad3表达也明显升高。以上结果均表明,细胞浆与细胞核中的S1OOA11可激活经典的TGFβ/Smad信号通路,敲低S1OOA11后,可逆转此现象的发生。5.体内胞浆胞核中分别过表达S100Al1可促进结直肠癌细胞的成瘤能力和肺内定植能力5.1稳定过表达S100Al1结直肠癌细胞株SW480的构建与鉴定将HA-和HA-S100A11-、HA-NLS-S100A11-、HA-NES-S100A11-重组表达载体分别转染SW480细胞,G418加压筛选挑取单克隆扩大培养,免疫荧光检测结果显示SW480/HA-S100A11的外源性S1OOA11定位于胞浆与胞核,S W480/HA-NLS-S100A11的外源性S1OOA11定位于细胞核,SW480/HA-NES-S100A11的外源性S1OOA11定位于细胞浆,在此基础上进行免疫印迹检测,Western Blot检测结果表明已成功构建S100A11稳定过表达细胞,分别命名为SW480/HA、SW480/HA-S100A11、SW480/HA-NLS-S100A11、 SW480/HA-NES-S100A11,免疫荧光联合免疫印迹实验结果表明S100A11稳定过表达的细胞株构建成功,带有NLS核定位信号的载体能够将S1OOA11定位于胞核,带有NES核输出信号载体能够将S100A11输出至胞浆,且三种处理组载体稳定转入细胞中后,外源性HA表达明显高于对照组。5.2 S100A11稳定过表达体外实验CCK8实验结果显示,与对照组(SW480/HA)相比稳定过表达S1OOA11的细胞(SW480/HA-S100A11、SW480/HA-NLS-S100A11、SW480/HA-NES-S100A11)生长速度显著上升,组别和时间存在交互效应,差异具有统计学意义(P<0.05),实验结果表明胞浆、胞核亚细胞定位稳定过表达S100A11在体外均能够促进结直肠癌细胞的增殖；Transwell细胞迁移实验结果显示,相对于对照组,稳定过表达S100A11的细胞株(SW480/HA-S100A11、 SW480/HA-NLS-S100A11、SW480/HA-NES-S100A11)其迁移能力明显增强；划痕愈合实验结果显示,相对于对照组,稳定过表达S1OOA11的细胞株(SW480/HA-S100A11、S W480/HA-NLS-S100A11、SW480/HA-NES-S100A11)其迁移率明显增强。5.3 S100Al1稳定过表达体内实验裸鼠皮下成瘤实验结果显示,与对照组(SW480/HA)相比稳定过表达S100A11的细胞株(SW480/HA-S100A11、SW480/HA-NLS-S100A11、 S W480/HA-NES-S100A11)肿瘤生长速度较快,体积较大(P<0.05),同时,Ki-67的阳性率显著高于对照组SW480/HA (P<0.05, P<0.05, P<0.05);裸鼠尾静脉注射实验结果表明,稳定过表达S1OOA11的细胞株(SW480/HA-S100A11、 SW480/HA-NLS-S100A11、SW480/HANES-S100A11)与对照组(SW480/HA)相比肿瘤细胞肺定植能力明显增强,肺脏肿瘤结节数目明显增多(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。皮下瘤免疫组化结果显示,与对照组(SW480/HA)相比稳定过表达S100A11的细胞株(SW480/HA-S100A11、SW480/HA-NLS-S100A11、 SW480/HA-NES-S100A11)EMT间质指标Fibronectin增高,上皮指标E-cadherin减弱；HE显示处理组组织中肿瘤细胞坏死明显,与周围组织界限不清。6.S100A11调控结直肠癌转移分子机制的初步探讨6.1 S100All相互作用蛋白的筛选采用带HA标签抗体的Agarose亲和带HA标签的S100A11融合蛋白,结合的总蛋白经SDS-PAGE电泳分离。实验组为SW480/HA-NES-S100A11、 SW480/HA-NLS-S100A11、SW480/HA-S100A11,对照组为SW480/HA。经SDS-PAGE电泳分离,质谱联合银染后可见清晰蛋白条带,分析得到多条差异蛋白条带,初步筛选鉴定为Flotillin-1(脂筏蛋白)、Histone hlt(组蛋白h1t亚型)等。在HCT116细胞、SW620细胞、HA-NES-S100A11 SW480细胞中,S100A11作为诱饵蛋白可以下拉Flotillin-1; HCT116细胞、SW620细胞、HA-NLS-S100A11 SW480细胞中S100A11作为诱饵蛋白可以下拉Histone hlt。反过来,HCT116细胞、SW620细胞.HA-NES-S100A11 SW480细胞中,Flotillin-1作为诱饵蛋白可以下拉S100A11,HCT116细胞、SW620细胞、HA-NLS-S100A11SW480细胞中Histone hlt作为诱饵蛋白可以下拉S100A11；免疫荧光共聚焦结果再次证实。HCT116和SW620细胞中,S100A11与Flotillin-1、Histone hlt均存在共定位情况。免疫共沉淀和免疫荧光验证S100A11与Flotillin-1、Histone hlt存在相互作用。6.2 Flotillin-1、Histone hlt的生物学功能构建Flotillin-1、Histone hlt过表达载体,合成特异性siRNA。Transwell实验表明在HCT116细胞中过表达Flotillin-1、Histone hlt后,结直肠癌细胞侵袭能力明显增强(P<0.05、P<0.05),且TGFβ/Smad经典信号通路被激活；在HCT116细胞中干扰Flotillin-1、Histone hit后,结直肠癌细胞侵袭能力明显减弱(P<0.05、P<0.05),且TGFβ/Smad经典信号通路被抑制。6.3 Flotillin-1、Histone h1t通过TGFβ/LASP1/S100A11轴诱导结直肠癌EMT为了明确S100A11胞浆中Flotillin-1、胞核中Histone hit分别介导的分子机制,我们进行了如下的恢复实验。设立Control、S100A11、S100A11+si-Histone hit组和Control、S100A11、S100A11+si-Flotillin-1、TGFp+si-Flotillin-1、LASP1+ si-Flotillin-1组,Transwell和Western Blot实验结果均表明干扰掉Flotillin-1、 Histone hit后可中和TGFβ/LASP1/S100A11轴介导的迁移能力(P<0.05)和EMT的能力。结论：1.结直肠癌转移相关蛋白LASP1正向调节S100A11的蛋白表达,且LASP1和S100A11存在蛋白质相互作用2. LASP1通过S100A11介导结直肠癌细胞的侵袭性表型和EMT3.结直肠癌组织和细胞中,胞浆胞核S100A 11均有表达,且表达均明显上调,与结直肠癌患者不良预后相关；4.体外实验表明,亚细胞定位的外源性S100A11过表达后,促进结直肠癌的增殖迁移和划痕愈合能力并诱导EMT；干扰S100A11后,明显抑制结直肠癌的增殖迁移和划痕愈合能力并抑制EMT；5.体内试验表明,亚细胞定位的内源性S100A11的过表达可促进结直肠癌的成瘤能力和肺定植能力；6.S100A11下游靶蛋白胞浆中信号分子Flotllin-1、胞核中转录因子Histone H1,双重机制调控结直肠癌侵袭和转移。