论文部分内容阅读
食管癌是世界上第八种最普遍的癌症,也是第6大癌症死亡的因素。食管癌是全球内最未知、最危险的恶性肿瘤之一,其主要原因是其具有极强的侵袭性和较低的生存率。由于早期食管癌并无明显临床症状,所以大多数食管癌发展到晚期时才被诊断出来。近些年,食管腺癌在世界上的发病率逐年增长。目前,主要是通过化学治疗和放射治疗两种主要途径来医治食管癌患者,而首选化疗。化疗虽然能在特定范围内抑制肿瘤细胞的增殖,但是由于传统的抗癌药难以识别出肿瘤细胞与正常细胞,所以抗肿瘤药在抑制肿瘤细胞的同时,可能会抑制正常细胞增殖,从而对机体产生极大的伤害。因为癌细胞以及患癌组织内部结构极其繁琐,所以普通抗肿瘤药治疗难以产生明显的效果。此外,由于普通抗肿瘤药物在水中溶性差、无法长期在机体中循环和生物利用度较低等缺点,而无法完全治愈肿瘤。因此,急需找到更为有效的方法来治疗食管癌。近几年,透明质酸作为一种生物材料,引起人们的强烈兴趣。透明质酸(HA)是葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖通过糖苷键重复连接形成的线性多糖。透明质酸也是全部脊椎动物结缔组织中最为普遍的生物大分子。由于透明质酸的生物相容性、可降解性、无毒性和非免疫原性等良好的理化性质,因此,透明质酸在生物医学方面应用极其广泛。硫化氢是参与各种生理功能的重要介质,在癌症病理生理学中起着重要作用,能够抑制多种癌细胞的增殖。由于食管癌具有较高的发病率以及其不良预后,我们急需研发出更为新颖、安全、有效、具有新的靶点、预后不良反应更少的新型药物来预防和治疗食管癌,降低患者的死亡率。研究目的:将透明质酸与小分子硫化氢供体ADT-OH通过化学方法制成HA-ADT,增大小分子药物ADT-OH的溶解性、稳定性和靶向性,从而在一定程度上增加ADT-OH的生物利用度。并对HA-ADT抑制食管癌细胞(KYSE30和KYSE70)的作用机制进行探究。方法:以反式茴香脑和硫磺作为原料,在一定条件下反应得到ADT;然后对ADT进行脱甲基处理,通过反应得到ADT-OH;最终把ADT-OH与HA通过化学反应,得到HA-ADT。本文通过1H-NMR、FT-IR、粒径、Zeta电位和TEM对化合物的结构、粒径、电位和外观形貌进行分析,并对硫化氢的体外释放量进行检测。体外实验:本文采用MTT比色法、CCK-8、Ed U试剂盒来探究3种硫化氢供体Na HS、GYY4137和HA-ADT对KYSE30和KYSE70细胞增殖的影响;采用划痕、Transwell、Invasion实验观察Na HS、GYY4137以及HA-ADT对KYSE30和KYSE70细胞的迁移以及侵袭产生的作用;通过菌落形成试验观察三种硫化氢供体对食管癌细胞克隆能力的影响;用TUNEL试剂盒和流式细胞仪检测H2S供体对人食管癌细胞凋亡的影响;通过流式细胞仪和Western blot检测硫化氢供体对细胞周期进程的影响;通过蛋白免疫印迹法观察硫化氢供体对KYSE30和KYSE70的凋亡蛋白、PI3K/AKT/m TOR途径、Wnt/β-Catenin途径以及自噬等有关蛋白表达量所产生的作用。体内实验:将人食管癌细胞KYSE30和KYSE70接种到裸鼠腋下观察硫化氢供体对人食管癌细胞成瘤率产生的作用;HE染色观察肿瘤组织学形态,并采用IHC实验分别观察CD31、Ki67、Cleaved caspase-3、Beclin-1和p21在四组肿瘤组织中表达量,并对其差异性进行比较。结果:1.观察1H-NMR、FT-IR结果并进行计算,HA-ADT接枝率达到19%。2.结合粒径、Zeta电位以及TEM结果,我们可以看出HA-ADT的粒径相对较小,粒度分布均匀,表面带负电电荷,HA-ADT呈圆球状,大小均一,表明该化合物具有良好的稳定性。3.硫化氢的体外释放结果提示了HA-ADT能缓慢持续释放H2S。4.根据MTT、CCK-8、Ed U结果以及统计可知,在0～300μM范围内,HA无显著细胞毒性,HA-ADT能够更好的抑制KYSE30和KYSE70细胞的活性和增殖。5.划痕、Transwell和Invasion结果提示,HA-ADT组的细胞迁移能力和侵袭能力明显降低。6.通过流式细胞仪以及蛋白印迹反应观察各组硫化氢供体对细胞周期的作用,结果显示,HA-ADT组显著抑制食管癌细胞的周期进程。7.菌落形成实验表明,HA-ADT使食管癌细胞的克隆能力显著减弱。8.由TUNEL实验、流式细胞仪检测凋亡实验以及凋亡相关蛋白的表达水平的检测结果表明,HA-ADT明显加快KYSE30和KYSE70细胞的凋亡。9.蛋白免疫印迹结果表明,HA-ADT组Beclin-1的表达量降低,Lc3A/B、P62的蛋白表达量表现为升高的趋势。10.蛋白印迹结果表明,HA-ADT显著降低p-PI3K/p-AKT/p-m TOR以及Wnt3a/p-β‐Catenin/p‐Gsk‐3β蛋白的表达水平。11.裸鼠异种移植瘤结果显示,HA-ADT组的移植瘤体积显著减小。12.苏木精-伊红染色提示,HA-ADT组的细胞核减小,细胞间质增加,坏死面积增加。13.根据Ki67、CD31、Cleaved caspase-3、Beclin-1和p21的IHC结果显示,HA-ADT显著降低移植瘤组织的微血管密度,同时增加凋亡指数,调节自噬,抑制细胞周期进程。结论:实现了将HA与ADT-OH通过化学键连着形成HA-ADT。HA-ADT的化学性质稳定,水中溶解性较好。由体内外实验可知,以Control组作为对照,当硫化氢供体药物浓度均为200μM时,与Na HS和GYY4137相比,HA-ADT能更好抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭、周期进程,促进食管癌细胞的凋亡。所以,HA-ADT可作为一种极具潜力的抑制肿瘤生长的新型药物。