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我国首创的VC两步发酵法是惟一应用于大规模工业生产VC微生物转化法,其第一步为醇糖转化,由葡糖杆菌(俗称一步菌)将D-山梨醇转化为L-山梨糖；第二步为糖酸转化,由普通生酮基古龙酸菌(俗称小菌)与其伴生菌(俗称大菌)的混合菌系将L-山梨糖转化为VC前体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。两步发酵法的糖酸转化效率很高,但需要两步发酵,三种微生物共同参与。若能应用现代生物技术将参与两步发酵的相关基因整合在单一宿主菌中表达,构建一步发酵工程菌,可简化生产工艺、提高工艺稳定性、节省生产成本,从而提升我国VC产业的竞争力和科技地位。本研究从VC生产菌株中分离转化的相关基因,为一步菌的构建奠定基础。本课题组已从小菌基因文库中分离得到了一种山梨糖脱氢酶基因(sdh),其表达产物山梨糖脱氢酶(SDH)能在体外将L-山梨糖转化为2-KGA,但在大肠杆菌体内却不能完成转化。本研究试图通过转座诱变和突变基因分析筛选VC两步发酵菌中醇糖和糖酸转化的其他相关基因。利用Tn5转座系统对酮古龙酸菌SCB329进行了诱变,筛选不能进行糖酸转化的突变株。从750株SCB329突变株中得到1株不产酸的变株,该突变株可望用于研究糖酸转化转化机制或寻找相关基因。建立了葡糖杆菌的Tn5诱变系统,实现了Tn5转座对葡糖杆菌的诱变,为葡糖杆菌山梨醇代谢途径研究及相关基因分离奠定了基础。利用SOLEXA技术对酮古龙酸菌SCB329进行全基因组分析,测序结果通过软件分析和数据库比对,预测得到了基因组上山梨糖脱氢酶的开放阅读框。从SCB329基因组上扩增出7个可能的山梨糖脱氢酶的基因编码框,并连接入带有小菌启动子的表达载体pBMP3上,在大肠杆菌中进行表达。经活性染色、体外转化反应等方法考察表达产物的活性,发现其中1个读框的表达产物具有山梨糖脱氢酶活性。该基因编码579个氨基酸残基组成的蛋白,pI为4.15,其生物活性严格依赖PQQ,能够催化多种含羟基及羰基化合物脱氢,并能在体外将L-山梨糖直接转化为2-KGA。根据该蛋白的上述特性,将其命名为醇醛脱氢酶(AADH)。该酶的发现对于SCB329糖酸转化机制的研究具有一定价值。