目的:胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)是导致2型糖尿病、动脉粥样硬化等疾病的危险因素,是2型糖尿病的基本特征。胰岛素抵抗和2型糖尿病状态下,血中游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)增加,肝脏中的游离脂肪酸和甘油三酯也增加。肝脏的脂肪酸有以下代谢途径:一是进入线粒体进行β-氧化。肉碱脂酰转移酶Ⅰ(carnitine palmitoyltransferaseⅠ,CPTⅠ)是线粒体氧化长链脂肪酸的关键酶。二是进入过氧化物酶体进行β-氧化。软脂酸辅酶A氧化酶(palmitoyl-CoA oxidase,ACOX1)主要参与直链极长链脂肪酸氧化;降植烷酰辅酶A氧化酶(pristanoyl-CoA oxidase, ACOX3)主要参与支链脂肪酸的氧化。酯酰辅酶A氧化酶2(acyl-CoA oxidase 2, ACOX2)催化三羟及二羟胆甾烷酰基辅酶A侧链的氧化脱氢,参与胆汁酸的合成。三是再酯化合成甘油三酯。二酰基甘油酰基转移酶(diacylglycerol transferase, DGATs)催化甘油三酯合成体系中最后一步,是甘油三酯合成的关键酶,它有两个亚型:DGAT 1和DGAT 2。上述途径共同维持肝脂肪酸代谢的动态平衡。糖尿病状态下,由于胰岛素作用缺陷引起葡萄糖利用障碍,使组织更多地依赖脂质氧化供给能量。研究发现,糖尿病和单纯胰岛素抵抗大鼠肝不仅线粒体脂肪酸β-氧化活性增强,而且过氧化物酶体脂肪酸β-氧化活性增强。在大剂量STZ所致糖尿病大鼠,过氧化物酶体脂肪酸β-氧化活性增强与ACOX 1的mRNA表达增加有关。那么在2型糖尿病和单纯胰岛素抵抗状态下,线粒体和过氧化物酶体脂肪酸β-氧化活性的增强与β-氧化途径中哪些酶基因表达增加有关呢?过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα),是核受体转录因子,被配体激活后,通过调控线粒体和过氧化物酶体β-氧化途径中的CPTⅠ、ACOX1、LBP等下游基因的转录,增加脂肪酸的分解代谢。研究发现,大剂量STZ所致糖尿病大鼠肝组织PPARα表达是增加的,那么2型糖尿病和单纯胰岛素抵抗状态下PPARα表达如何呢?胰岛素抵抗和2型糖尿病状态下肝脏常伴有甘油三酯沉积,我室以前的研究也在胰岛素抵抗和2型糖尿病大鼠肝中发现此种现象。肝甘油三酯沉积是否与DGAT酶基因表达增加有关?基于上述目的,本实验以SD大鼠为对象,采用高脂饮食复制胰岛素抵抗模型,再复加腹腔注射小剂量STZ,复制2型糖尿病模型。在此基础上,观察肝组织脂肪酸代谢调节因子PPARα基因,线粒体和过氧化物酶体脂肪酸β氧化相关酶CPTⅠ、ACOX1、ACOX2、ACOX3、LBP、DBP、THLA、THLB、SCPx基因,以及甘油三酯合成限速酶DGAT 1和DGAT 2基因的表达情况,从而探讨胰岛素抵抗和2型糖尿病状态下肝脏脂质代谢紊乱的分子机制。方法:1实验动物分组及标本处理根据本试验室王晓凌等的造模方法,以成年雄性SD大鼠(体重220-240g)为实验对象,用高脂饮食(脂类以猪油为主,热量比占59.8%)复制胰岛素抵抗模型(insulin resistance group, IR);在胰岛素抵抗的基础上,一次性注射小剂量STZ复制2型糖尿病大鼠模型(diabetic mellitus group, DM)。血清,用于血糖、血总游离脂肪酸测定;肝脏组织,用于肝组织油红染色,肝总游离脂肪酸,甘油三酯含量测定,及总RNA提取。2血糖测定用HITACHI 7170A型全自动生化分析仪,氧化酶法测定血糖。以mmol/L表示。3血清及肝组织总游离脂肪酸的测定用南京建成总脂肪酸测定试剂盒,铜显色法测定血清和肝组织总游离脂肪酸的含量。分别用mmol/L和μmol/gprot表示。4肝组织甘油三酯含量的测定用氧化酶法测定肝甘油三酯含量,结果用每克肝组织所含甘油三酯微摩尔数表示(μmol/g组织)。5肝组织有关基因mRNA表达的测定用Promega总RNA提取试剂盒提取肝组织总RNA。用NanoDrop ND-1000紫外/可见光光度计进行RNA定量。以18S rRNA做内参,real-time PCR测定PPARα、CPTⅠ、ACOX1、ACOX2、ACOX3、LBP、DBP、THLA、THLB、SCPx、DGAT 1和DGAT 2 mRNA的相对表达量。6数据处理所有数据均用?x±s表示,采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,对所测定结果进行正态性及方差齐性检验,做两个独立样本t检验(双尾),检验以P < 0.05为差异有统计学意义。结果:1造模1.1 OGTT试验验证胰岛素抵抗我室王晓凌等已经通过OGTT、ISI和血糖钳试验证实,此种造模方法,大鼠于高脂喂养8周时产生明显胰岛素抵抗,因此,在我们的试验中,只用OGTT试验验证胰岛素抵抗的产生。高脂喂养组的糖耐量曲线下面积(AUC)平均值为31.138±1.797mmol/L*h ,高于对照组27.822±1.271mmol/L*h,差异有统计学意义(P < 0.01)。(AUC=0.5×空腹血糖+30 min血糖+1.5×60 min血糖+120 min血糖)表明,胰岛素抵抗模型成立。2空腹血糖变化空腹血糖对照组为4.966±0.433mmol/L,单纯胰岛素抵抗组为5.511±0.345mmol/L,糖尿病组为12.717±1.862mmol/L。单纯胰岛素抵抗组与对照组相比空腹血糖增加,差异有统计学意义(P < 0.01);糖尿病组和对照组相比,空腹血糖增加,差异有统计学意义(P < 0.01)。表明,糖尿病模型成立。3血清总游离脂肪酸的变化对照组为0.581±0.114mmol/L,单纯胰岛素抵抗组为1.602±0.112mmol/L,糖尿病组为1.558±0.084mmol/L。与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组血清总游离脂肪酸均增加,差异有统计学意义(P<0.01)。表明,单纯胰岛素抵抗和糖尿病状态下,机体脂代谢异常。4肝组织总游离脂肪酸的变化对照组为81.365±10.609μmol/gprot,单纯胰岛素抵抗组为213.922±40.809μmol/gprot,糖尿病组为156.080±19.268μmol/gprot。与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组肝组织总游离脂肪酸均增加,差异有统计学意义(P < 0.01)。5肝组织油红染色油红染色显示,Con组仅发现极少量脂滴存在;HF组和DM组出现大量弥漫性脂肪滴,表明胰岛素抵抗和糖尿病组大鼠肝组织脂肪沉积。6肝组织甘油三酯含量的变化对照组肝组织脂肪含量为11.30±1.89μmol/g组织,单纯胰岛素抵抗组为34.94±4.93μmol/g组织,糖尿病组为51.47±7.77μmol/g组织。与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组肝组织甘油三酯含量均增加,差异有统计学意义(P < 0.01)。结果4-6表明,单纯胰岛素抵抗和糖尿病状态下,肝组织脂代谢异常。7待测基因mRNA相对表达量的变化7.1 PPARαmRNA的相对表达量对照组为1.758±0.231,单纯胰岛素抵抗组为1.885±0.262,糖尿病组为2.340±0.458。PPARα的相对表达量,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组变化无统计学意义(P > 0.05);糖尿病组表达增加,差异有统计学意义(P <0.01)。7.2 CPTⅠmRNA的相对表达量对照组为4.338±0.923,单纯胰岛素抵抗组为3.087±0.446,糖尿病组为2.964±0.078。CPTⅠ相对表达量,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组均降低,差异有统计学意义(P < 0.01)。表明,单纯胰岛素抵抗和糖尿病肝线粒体长链脂肪酸的β氧化活性可能下降。7.3过氧化物酶体β氧化相关酶基因表达变化7.3.1胰岛素抵抗状态下酶基因表达变化7.3.1.1 ACOX1 mRNA的相对表达量对照组为12.061±1.154,单纯胰岛素抵抗组为13.074±0.640,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组ACOX1相对表达量增加,差异有统计学意义(P <0.05)。7.3.1.2 LBP mRNA的相对表达量对照组为2.316±0.604,单纯胰岛素抵抗组为3.332±0.340,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组LBP的相对表达量增加,差异有统计学意义(P <0.01)。7.3.1.3 THLA mRNA的相对表达量对照组为0.0294±0.0032,单纯胰岛素抵抗组为0.0371±0.0063,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组THLA的相对表达量增加,差异有统计学意义(P <0.01)。7.3.1.4 THLB mRNA的相对表达量对照组为0.388±0.048,单纯胰岛素抵抗组为0.646±0.125,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组THLB的相对表达量增加,差异有统计学意义(P <0.01)。7.3.1.5 ACOX3 mRNA的相对表达量对照组为4.315±0.312,单纯胰岛素抵抗组为5.041±0.392,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组ACOX3的相对表达量增加,差异有统计学意义(P <0.01)。7.3.1.6 DBP mRNA的相对表达量对照组为6.588±0.317,单纯胰岛素抵抗组为8.084±0.225,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组DBP的相对表达量增加,差异有统计学意义(P <0.01)。7.3.1.7 SCPx mRNA的相对表达量对照组为12.136±1.980,单纯胰岛素抵抗组为18.762±3.446,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组SCPx的相对表达量增加,差异有统计学意义(P<0.05)。7.3.1的结果表明,胰岛素抵抗状态下肝过氧化物酶体脂肪酸β-氧化增强,与上述所有酶基因表达增加有关,直链和支链极长链脂肪酸的氧化可能均增加。7.3.2糖尿病状态下酶基因表达变化7.3.2.1 ACOX1 mRNA的相对表达量对照组为12.061±1.154,糖尿病组为14.335±0.561,与对照组相比,糖尿病组ACOX1相对表达量增加,差异有统计学意义(P < 0.01)。7.3.2.2 LBP mRNA的相对表达量对照组为2.316±0.604,糖尿病组为4.349±0.544,与对照组相比,糖尿病组LBP的相对表达量增加,差异有统计学意义(P <0.01)。7.3.2.3 THLA mRNA的相对表达量对照组为0.0294±0.0032,糖尿病组为0.391±0.014,与对照组相比,糖尿病组THLA的相对表达量增加,差异有统计学意义(P <0.01)。7.3.2.4 THLB mRNA的相对表达量对照组为0.388±0.048,糖尿病组为1.956±0.236,与对照组相比,糖尿病组THLB的相对表达量增加,差异有统计学意义(P <0.01)。7.3.2.5 ACOX3 mRNA的相对表达量对照组为4.315±0.312,糖尿病组为4.564±0.528,与对照组相比,糖尿病组ACOX3的相对表达量变化无统计学意义(P >0.05)。7.3.2.6 DBP mRNA的相对表达量对照组为6.588±0.317,糖尿病组为8.369±0.762,与对照组相比,糖尿病组DBP的相对表达量增加,差异有统计学意义(P <0.01)。7.3.2.7 SCPx mRNA的相对表达量对照组为12.136±1.980,糖尿病组为12.661±0.976,与对照组相比,糖尿病组SCPx的相对表达量变化无统计学意义(P >0.05)。7.3.2的结果表明,糖尿病状态下肝过氧化物酶体脂肪酸β-氧化增强,与ACOX1、LBP、DBP、THLA/B表达增加有关,直链极长链脂肪酸的氧化可能增加。7.4甘油三酯合成相关酶基因变化7.4.1 DGAT 1 mRNA的相对表达量对照组为0.485±0.051,单纯胰岛素抵抗组为0.659±0.031,糖尿病组为0.702±0.053。DGAT 1的相对表达量,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组均增加,差异有统计学意义(P <0.05)。7.4.2 DGAT 2 mRNA的相对表达量对照组为4.267±0.687,单纯胰岛素抵抗组为6.030±0.952,糖尿病组为4.886±0.447。DGAT 2的相对表达量,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组均增加,差异有统计学意义(P <0.05)。7.4的结果表明,胰岛素抵抗和糖尿病状态下,肝组织甘油三酯合成增加可能与DGAT 1及DGAT 2表达增加有关。7.5 ACOX2 mRNA的相对表达量对照组为0.099±0.018,单纯胰岛素抵抗组为0.072±0.015,糖尿病组为0.098±0.016。ACOX2相对表达量,与对照组相比,单纯胰岛素抵抗组表达降低,有统计学差异(P <0.01),糖尿病组变化无统计学差异(P > 0.05)。表明胰岛素抵抗状态下很可能胆汁酸的合成是降低的。结论:1胰岛素抵抗状态下,肝过氧化物酶体脂肪酸β-氧化的增加与ACOX1、LBP、THLA/B、ACOX3、DBP、SCPx基因的表达增加有关;肝线粒体脂肪酸β-氧化的增加与CPTⅠ基因的表达无关。2糖尿病状态下,肝过氧化物酶体脂肪酸β-氧化增加与ACOX1、LBP、DBP、THLA/B基因表达增加有关;肝线粒体脂肪酸β-氧化增加与CPTⅠ基因的表达无关。3胰岛素抵抗及糖尿病状态下,肝组织甘油三酯沉积与DGAT 1和DGAT 2基因的表达增加有关。