论文部分内容阅读
[目 的]明确发育早期C57BL/6J小鼠脑内少突胶质细胞的改变,及其与髓鞘的时空动态变化,为HIBD后髓鞘化异常的机制提供理论依据。[方 法]1.将小鼠按出生时间分为出生后1 d、3d、5 d、7 d、10 d、14 d、28 d七个组。采用免疫荧光染色观察各组OLs谱系的标记物Olig2和成熟OLs的标记物MBP表达的变化。2.用Luxol Fast Blue染色观察各组脑髓鞘形成的变化。3.C57BL/6J小鼠通过经典的Vannucci改良方法建立小鼠HIBD模型,根据是否手术及手术后通过大体观察、TTC染色、激光散斑脑血流成像、HE染色判断模型后脑组织损伤程度。4.通过Luxol Fast Blue染色观察HIBD后脑组织髓鞘形成的变化。5.通过免疫荧光染色,蛋白质免疫印迹观察HIBD后脑组织髓鞘形成改变的可能原因。6.P0d新生C57BL/6J小鼠大脑皮层混合细胞提取培养,经分离纯化出原代OPCs,光镜下观察纯化后原代细胞形态。7.对纯化后的原代OPCs进行OGD实验,光镜下观察OGD实验对原代OPCs形态的影响。8.对OLN93细胞系进行OGD实验,用流式细胞仪检测正常对照组和OGD实验组细胞的增殖能力。[结 果]1.出生后1d即有Olig2阳性细胞表达,并且始终在胼胝体区聚集,其他位置分布均匀;出生后1d、3d、5d时无MBP表达,MBP在出生后7 d首次出现在胼胝体和纹状体,胼胝体处呈均匀排列的条索状,在纹状体处呈团块状;出生后10d,并胝体外侧大量MBP朝皮层方向径向延伸;出生后28 d,并胝体处MBP呈致密的片状,皮层及皮层下可见均匀分布的丝状MBP。2.Luxol Fast Blue染色显示,在出生后28 d时观察到成熟的髓鞘形成,它在胼胝体处致密均匀连接成片,纹状体处呈分散的团块状。其余时间点未见髓鞘形成。3.HIBD后1d及3d,与正常组相比,一组小鼠脑组织损伤同侧大体观可见白色不透明区域、TTC染色可见白色梗死灶、激光散斑脑血流成像可见脑血流量明显减少(p<0.05),HE染色可见液化性坏死,我们将其归为重度损伤组(HI-S),另一组小鼠脑组织损伤同侧无明显改变,我们将其归为轻度损伤组(HI-M)。4.HIBD后18 d及9 M,HI-M组及HI-S组小鼠脑组织损伤同侧胼胝体处髓鞘均出现断裂。5.HIBD后1d及3 d,HI-M组小鼠脑组织损伤同侧Olig2+细胞数无明显改变且MBP形态无明显变化,HI-S组小鼠脑组织损伤同侧梗死周围区Olig2阳性细胞数增加(p<0.0002)、MBP部分缺失,断裂,排列疏松紊乱;HIBD后9M,HI-M组小鼠脑组织损伤同侧Olig2阳性细胞数无明显改变,胼胝体膝部MBP断裂、髓鞘断裂。HI-S组小鼠脑组织损伤同侧Olig2阳性细胞数无明显改变,胼胝体处MBP曲折断裂,髓鞘变形断裂,形态异常,且HI-S组MBP及髓鞘的形态改变较HI-M组严重。6.HIBD后1d,HI-M组小鼠脑组织损伤同侧F-actin无明显变化,HI-S组小鼠脑组织损伤同侧梗死区周围F-actin形态与N组无明显差异。7.HIBD后3 d,HI-M组及HI-S组损伤同侧脑组织胼胝体区MBP表达量逐渐降低,Tau5表达量逐渐升高,pT205表达量逐渐升高。8.光镜下,纯化后的OPCs多为双极,少数为三极或多极;原代OPCs经OGD实验3 h后,细胞回缩变圆。9.OGD实验组中处于增殖周期中的OLN93细胞数较正常组少。[结论]1.C57BL/6J小鼠出生后1-7 d为幼稚OLs发育阶段,7d后OLs开始发育成熟,出生后28 d在脑内可观察到成熟的髓鞘;2.C57BL/6J小鼠HIBD后影响正常结构髓鞘的形成;3.C57BL/6J小鼠HIBD后Tau5及pT205均参与了髓鞘化异常的过程;4.糖氧剥夺后损伤了原代OPCs,推测由此影响正常髓鞘化过程;5.Olig2阳性细胞增多未能改变髓鞘化的异常。