刺参位列“海八珍”之一,具有较高的营养和药用价值,是我国海水养殖产业中单一产值最大的养殖物种。当海水温度升高到一定范围时,刺参会隐藏于较深较安静的海底进入夏眠。在长达4个月的夏眠期间,刺参会表现出明显的休眠特征:停止活动和摄食,消化道萎缩退化,代谢减退及体重明显减轻。夏眠习性无疑大大延长了刺参养殖周期,增加了养殖成本,因此刺参夏眠研究具有重要的科学意义和产业指导意义。目前,关于刺参夏眠的研究主要集中于组织学、生理学、能量及免疫调控等方面,分子生物学层面的研究较少,夏眠的分子调控机理尚不明确。本研究探索分析了刺参夏眠期间的DNA甲基化特征,揭示了刺参夏眠的基因表达全局调控模式,为进一步探讨刺参夏眠分子调控机理提供理论参考。本文以刺参夏眠过程中的三个关键代表性阶段(正常生长期、深度夏眠期和夏眠解除期)的不同组织(肠道、呼吸树、肌肉和体壁)为材料,利用高通量测序等分子生物学相关技术手段,筛选了适合于夏眠期间刺参不同组织的最优内参基因组合;建立了刺参夏眠不同阶段肠道和呼吸树组织表达谱,揭示了刺参夏眠过程中的基因全局表达模式;克隆分析了刺参甲基化修饰系统关键基因Dnmt1和Mbd2/3的cDNA全长及其在夏眠各阶段的表达水平;检测分析了刺参不同组织在夏眠各阶段的基因组DNA甲基化水平变化,初步证实DNA甲基化与刺参夏眠调控密切相关。主要研究结果如下:1.分析研究了八个常用刺参候选内参基因在夏眠期的表达稳定性,结果表明各候选内参基因在刺参夏眠各组织中呈现差异的表达模式。进一步筛选优化出适合于刺参夏眠期间不同组织的最佳内参基因组合:肠道组织最优内参基因组合为RPS18、TUBB和NADH;呼吸树组织最优内参基因组合为ACTB、TUBB和SDHC;肌肉组织最优内参基因组合为TUBA和NDUFA13。2.采用RNA-seq技术构建刺参肠道和呼吸树夏眠关键时期的基因表达谱,揭示整个夏眠过程的全局基因表达模式并筛选出一系列参与夏眠调控的关键差异表达基因,分析了肠道和呼吸树组织基因表达的共同性和组织特异性。夏眠期间两种组织差异表达基因主要涉及广泛代谢抑制过程(尤其高耗能生物过程)、能量重调过程以及机体防御与免疫启动过程,而呼吸树组织中细胞周期调控受到明显抑制,表观遗传相关基因转录水平明显变化。这些基因可作为候选基因为后续深入开展夏眠分子调控机理研究搭建平台。3.克隆获得了刺参DNA甲基化修饰系统中关键基因Dnmt1和Mbd2/3的cDNA全长。刺参Dnmt1基因序列与脊椎动物具有较高的同源性,而Mbd2/3基与脊椎物种的Mbd2和Mbd3基因均具有较高的同源性,且与棘皮动物海胆和海星的Mbd2/3同源关系最近。两者均在刺参深度夏眠期肠道组织中表达显著上调,且mbd2/3在深度夏眠期和夏眠解除期的呼吸树组织中持续显著上调表达,推测上述两基因均参与了刺参夏眠期间的甲基化调控,其作用位点主要在肠道和呼吸树组织。4.F-MSAP分析表明刺参四种组织基因组DNA均存在甲基化修饰,不同组织甲基化水平分布在28%-56%范围之间。深度夏眠期,肠道和呼吸树中甲基化水平显著升高,且差异主要表现在全甲基化水平上,而半甲基化水平变化并不显著。肌肉和体壁组织在夏眠各阶段的基因组甲基化水平变化不显著。这一结果直接证实了刺参夏眠期间发生了DNA甲基化调控修饰,且调控位点发生于受夏眠影响最为明显的肠道和呼吸树组织中。