目的：原发性高血压病属于国家重大疾病研究范围,是多基因遗传因素与环境因素交互作用产生的一种疾病,是全球范围内威胁人类生命的主要疾病之一。血压的昼夜节律特征己逐渐成为评估降压措施,降低心血管事件危险性的一项重要指标。因此,深入研究血压节律变异与靶器官受损的深层次机制并找出恰当的应对方式及作用机制就成为必要。本课题采用调肝肾、祛痰瘀复方不同时间给药的方法,从授时因子一心脏生物钟正负调节回路入手,从调控机体昼夜节律角度,探讨防治高血压及对靶器官保护效应及机制,与中医学天人相应、因时制宜理论非常契合,使得在中医药理论和实践经验的指导下,以新的研发策略进行防治高血压病药物的研发成为可能。内容与方法：研究内容：包括六个部分：(1)SD大鼠和9周龄SHR大鼠动态血压的比较和研究；(2)不同周龄SHR大鼠(9周龄、15周龄、20周龄、25周龄、30周龄SHR大鼠)血压参数及血压节律研究；(3)不同时间给药(血压峰值前给药、子午时给药、卯酉时给药、西药常规给药)对血压及血压节律的影响；(4)不同时间给药对心脏生物钟基因(per2、cry、bmall基因表达和per2、bmall蛋白含量)的研究；(5)不同时间给药对RAS系统(血管紧张素原含量、ATIR、AT2RmRNA表达)的影响；(6)不同时间给药对靶器官(心、肾、动脉)保护作用研究。实验方法：1.调肝肾、祛痰瘀复方(成人一日量)熟地25g、龟板30g(先煎)、丹参15g、瓜蒌12g、田七5g、钩藤12g(后下)以上药材均购于广东康美药业,并经过鉴定符合药典标准。常规煎药取汁后浓缩含生药0.99g/ml。药液冷却后,置于4℃冰箱内保存备用.2.实验动物及分组实验采用自发性高血压大鼠(即SHR)模型,购于北京维通利华生物科技有限公司,雄性,9周龄,200-220g左右。分组：分为9组：即峰值前给药高剂量组(A)、峰值前给药低剂量组(B)、时间对照1高剂量组(C)、时间对照1低剂量组(D)、时间对照2高剂量组(E)、时间对照2低剂量组(F)、西药组(G)、模型组(H)、对照组(Ⅰ)。其中,峰值前给药组给药时间为19：00和0：00；时间对照1组给药时间为子午时(12：00和0：00)；时间对照2组给药时间为卯酉时(6：00和18：00)。西药组给药时间,按照西药常规给药为早上6：30。取材：从9：00开始每隔4个小时取材一次,(即9：00、13：00、17：00、21：00、1：00、5：00)共6个时间点,依次为用ZTO、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16、ZT20表示,每个时间点至少要3只老鼠。考虑到灌胃时间过长,所以每组多预留4只,每组共22只大鼠。3.给药及喂养方式SHR组于第十周开始灌胃给药。中药组每天按照不同时间点灌胃两次,高剂量2g/ml,低剂量组lg/ml。按照临床等效剂量,中药高剂量为2m1/100g,低剂量组为lml/100g,西药组灌胃一次,剂量为3mg/100g,模型组和空白对照组不给药。结果：1.大鼠的节律与人的节律比较研究正常人夜间血压低,清晨4：00-5：00开始上升,早晨9：00-11：00基本上达到最高峰,之后平稳下降,在下午16：00-18：00再次出现小高峰,其后逐渐下降,夜间2：00-3：00处于低谷,即正常生理状态下血压的“双峰一谷”近日节律,与正常人昼高夜低的血压节律大致相反,大鼠从17：00左右开始苏醒,然后血压开始上升,到21：00左右出现第一个高峰,然后在凌晨2：00左右出现一个次高峰,之后开始下降。同样呈现双峰一谷的昼夜节律。根据血药浓度的一个达峰时间大约是在2h左右,所以选择峰值前给药时间为19：00和0：00。2.SHR血压参数比较利用不同周龄SHR(9周龄、15周龄、20周龄、25周龄、30周龄SHR大鼠)的动态血压相关血压系数(包括动态血压、白天平均收缩压、夜间平均收缩压、24h平均收缩压、血压夜间下降率)和血压节律进行比较,得出30周龄SHR大鼠的血压节律紊乱,呈现重度非勺型,所以选择30周龄时取材。3.血压水平及血压节律比较(1)血压水平方面：西药组从第二周开始显示出降血压的效果,并持续降低血压。峰值前给药高剂量组从第四周开始显示降血压的效果,并一直平稳降压,效果逐渐接近西药组,灌胃第12周到第16周期间,与西药组没有统计学意义；其他时间给药中药高剂量组从第六周开始显示降压效果,并一直持续平稳降压,但效果略差于西药组和峰值前高剂量组。(2)血压节律方面：相比模型组,各个治疗组均有一定的血压节律保护作用；峰值前高低剂量组对血压节律调控均优于西药组。4.对心脏生物钟系统影响(1)SHR大鼠各组不同时间点心肌组织中bmall、cry、per2mRNA表达：建立RT-PCR方法考察调肝肾、祛痰淤复方不同时间给药对心肌生物钟基因bmal11、cry、per2mRNA的影响,结果表明心肌组织中,各组间24h内六个时间点(ZT0、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16、ZT20)均有表达。与对照组相比,各治疗组均呈现下调趋势,并且呈现一定的昼夜节律。其中,bmal1mRNA虽然各时间点表达有一定的节律差异,除时间对照1低剂量和时间对照2低剂量组外,均表现为昼低夜高的节律性；crymRNA表达中,除时间对照2组外,均呈现昼低夜高的节律性,其峰值大致出现在ZT12(21：00),与血压节律吻合；per2mRNA表达中,除时间对照2高剂量组外,其他各组均呈现一定的节律性,其峰值出现在ZT12(21：00),与血压节律大致吻合。(2)SHR大鼠心肌组织不同时间点比较：建立Western Blot方法考察bmall和per2蛋白含量,结果表明相比起模型组均呈现下调趋势,并呈现出一定的昼低夜高的节律性(bmall蛋白表达中,峰值低剂量组除外),峰值大致出现在ZT16(1：00)。5.对RAS系统影响(1)使用Elisa试剂盒检测不同时间点的血管紧张素原含量,结果表明：各组不同时间点血管紧张素原含量与模型组相比,各组中血管紧张素原的含量均降低,并呈现一定的日节律性。除了模型组外,各组均在ZT12即21：00时,血管紧张素原含量达到峰值,与前面血压节律研究结果一致。(2)各组不同时间点AT1RmRNA与AT2RmRNA表达：各组大鼠在24h内六个时间点的心肌组织中,均有表达。与模型组相比,各治疗组的AT1RmRNA的表达量均有降低,AT2RmRNA的表达量则增加。在表达节律和时相方面,AT1RmRNA呈现昼低夜高的节律性,峰值出现在ZT16(1：00),与per2蛋白和bmall蛋白表达出现的峰值一致。AT2RmRNA则白天逐渐下降,夜间逐渐增加的节律变化,谷值出现在ZT12(21：00)6.靶器官保护(1)心脏LVH比较模型组>时间对照2低剂量组>时间对照2高剂量组>时间对照1低剂量组>峰值前给药低剂量组>西药组>时间对照1高剂量组>峰值前给药高剂量组>对照组；(2)心肌损伤程度模型组>时间对照2低剂量组>西药组>时间对照1低剂组>时间对照2高剂量组>时间对照1高剂量组>血压峰值前给药低剂量组>血压峰值前给药高剂量组>对照组；(3)肾脏损伤程度模型组>西药组>时间对照2低剂量组>时间对照1低剂量组>时间对照2高剂量组>血压峰值前给药低剂量组>血压峰值前给药高剂量组>时间对照1高剂量组>对照组；(4)动脉损伤程度模型组>西药组>时间对照2低剂量组>时间对照1低剂量组>时间对照2高剂量组>血压峰值前给药低剂量组>血压峰值前给药高剂量组>时间对照1高剂量组>对照组。结论：1.调肝肾、祛痰淤复方能够有效地降低SHR大鼠血压,保护SHR大鼠心、肾、动脉等靶器官,对血压节律也有一定调控作用；2.不同时间给予调肝肾、祛痰淤复方对血压和血压节律效果有一定的差异,血压峰值前给药在降低血压和调节血压节律方面效果较好；3.血压昼夜节律与RAS系统和生物钟系统密切有关。