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研究目的:通过肿瘤公共数据库分析DNA甲基化结合蛋白3(Methyl-CpG-binding domain 3,MBD3)在胰腺癌组织中的表达及其与相关临床指标的关系,探究MBD3对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响,初步阐明MBD3抑制胰腺癌细胞上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)作用的分子机制。研究方法:1.通过肿瘤公共数据库分析MBD3在胰腺癌组织中mRNA水平的表达情况,并研究其与患者相关临床指标的联系。2.通过荧光定量PCR和Western blot检测MBD3在SW1990、PaTu8988、PANC1三种胰腺癌细胞株的表达水平。3.设计并构建干扰质粒sh-MBD3和过表达质粒Flag-MBD3,并在mRNA和蛋白水平验证质粒效果。4.将干扰质粒sh-MBD3转入相对高表达MBD3的PANC1和PaTu8988细胞,将过表达质粒Flag-MBD3转入相对低表达MBD3的PaTu8988和SW1990细胞,通过CCK-8法、克隆形成实验、干细胞成球实验、Transwell迁移及侵袭实验检测MBD3对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。5.通过Western blot法检测MBD3在胰腺癌细胞中对EMT相关指标、侵袭相关指标及细胞干性相关指标的影响。6.在胰腺癌细胞中上调或下调MBD3,采用Western blot法检测TGF-β/Smad信号转导通路相关指标的变化。研究结果:1.分析肿瘤公共数据库发现胰腺癌组织中的MBD3在mRNA水平低于癌旁组织。通过分析MBD3与临床相关指标间关系,发现MBD3与胰腺癌分期呈负相关。Log-Rank检验分析发现MBD3低表达组患者的总体生存时间显著低于MBD3高表达组。2.荧光定量PCR和Western blot结果表明MBD3 mRNA和蛋白表达水平在PANC1细胞最高,PaTu8988细胞次之,SW1990细胞最低。3.金斯瑞测序结果表明sh-MBD3和Flag-MBD3质粒构建成功,并验证。4.在PANC1和PaTu8988细胞中下调MBD3,其增殖能力、克隆形成能力、干细胞成球能力、迁移和侵袭能力提高。上调MBD3,PaTu8988和SW1990细胞增殖能力、克隆形成能力、干细胞成球能力、迁移和侵袭能力减弱。5.下调MBD3后,PANC1和PaTu8988细胞中EMT相关指标N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail、β-catenin蛋白表达量增高,E-cadherin蛋白表达水平降低,侵袭相关指标MMP2和MMP9蛋白表达量增高,干性指标Oct4、Sox2、Nanog蛋白表达量增高。在PaTu8988和SW1990细胞中上调MBD3,N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail、β-catenin蛋白表达量降低,E-cadherin蛋白表达量升高,MMP2和MMP9蛋白表达量降低,Oct4、Sox2、Nanog蛋白表达水平降低。6.Western blot结果表明,下调MBD3后,胰腺癌细胞中Smad2/3不变,p-Smad2、p-Smad3和TGF-β蛋白表达增高。上调MBD3后,Smad2/3不变,p-Smad2、p-Smad3和TGF-β蛋白表达水平下降。研究结论:MBD3在胰腺癌组织中相对低表达,并与胰腺癌患者临床分期呈负关联,MBD3低表达患者预后不佳。MBD3具有抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的生物学作用。MBD3通过TGF-β/Smad信号通路抑制胰腺癌细胞的上皮间质转化过程。