原发性胆汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis，PBC)是一种病因未明的慢性进行性胆汁淤积性肝脏疾病。其病理改变主要以肝内细小胆管的慢性非化脓性破坏、汇管区炎症、慢性胆汁淤积、肝纤维化为特征，最终发展为肝硬化和肝衰竭。多见于中年女性，男女比例约为1:9。PBC是一种典型的自身免疫性疾病，其细胞免疫及体液免疫均发生异常反应。抗原特异性T细胞与自身抗原、病原体之间发生了交叉反应使T细胞打破自身免疫耐受，激活的CD4及CD8T淋巴细胞持续伤害胆小管，肝细胞和胆管上皮细胞，使其对激活的T淋巴细胞敏感性增强，加重了免疫介导的细胞损伤。PBC患者主要的诊断指标是抗线粒体抗体阳性。PBC患者目前无特效治疗，主要就是针对症状的支持治疗，熊去氧胆酸是PBC的主要治疗药物。但该药只对部分患者有效，且只能延迟疾病进展。最终患者仍需选择肝移植治疗，但目前肝移植在我国开展仍不广泛，许多患者都得不到有效治疗，因此开发新的治疗方案显得尤为重要。　　 固有免疫系统是抵抗病原体感染的第一道防线，单核细胞则是固有免疫系统的重要力量，其表面存在可识别微生物相关分子模式(PAMP)的受体(PRR)。Toll样受体就是PRR的一种类型。胆管内皮细胞就是通过PRR来识别PAMP。有文献报道，固有免疫异常是PBC的重要发病特征，而PBC患者单核细胞功能亢进也是众所周知的。说明固有免疫可能参与PBC的发病，但具体机制仍需深入研究。　　 microRNA(miRNA)是近年来发现的一类在转录后水平对目的基因的表达进行调控的非编码RNA。与靶基因mRNA的3’端非编码区(UTR)结合后，miRNA可以直接抑制其翻译或者将其降解。研究表明，在机体的发育、肿瘤的产生、细胞的凋亡等众多生理或者病理过程中，microRNA都发挥着极为重要的调控作用。近年来，microRNA的免疫调控功能日渐引起了国内外学者的关注，基础免疫学的研究发现：microRNA是调控免疫细胞的发育、分化以及免疫应答过程的重要因子；临床免疫学研究也发现，多种自身免疫性疾病的发病机制与microRNA密切相关。　　 基于以上情况，本课题拟通过测定PBC患者外周血T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞中miR-302e表达情况，测定其生物学功能，并找到miR-302e靶基因，初步了解miR-302e在PBC固有免疫中的作用，从而为PBC的免疫学治疗提供新的靶点。　　 第一部分，PBC患者各细胞亚群内miR-302e的相对表达水平　　 最近的研究发现，PBC患者肝脏内有多个microRNh表达异常，提示microRNA参与了PBC的发病机制。本部分根据前期miRNA芯片表达谱筛选结果，选择了降幅比较明显的miR-302e，我们使用荧光定量PCR方法检测PBC患者及健康对照者PBMC中miR-302e表达量，使用磁珠分选，流式细胞术等方法分选了PBMC中T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞，使用荧光定量PCR方法检测三系细胞中miR-302e及miR-302a表达量。结果发现PBC患者PBMC中miR-302e的表达约为健康个体的30％，差异具有统计学意义(P<0.001)。PBC患者B细胞、T细胞和单核细胞内miR-302e的表达均较健康个体显著降低，其中尤以单核细胞内miR-302e的差异最为显著(P值均小于0.001)。作为对照，我们还同时检测了上述细胞亚群中miR-302a的表达差异，结果发现：PBC患者B细胞、T细胞和单核细胞内miR-302a的表达与健康对照个体之间的差异并不显著(P值均大于0.05)。　　 本部分研究说明PBC患者PBMC中miR-302e表达量较健康对照明显降低，并在单核细胞中表达最为明显。说明单核细胞内miR-302e表达下调在是PBC发病的重要特征。　　 第二部分，miR-302e负向调节LPS诱导THP-1细胞释放炎症因子的能力　　 在本部分研究中，我们通过改变特定免疫细胞内miRNA-302e的表达来分析其对细胞功能的调节作用。我们选用THP-1细胞，将miR-302emimics、inhibitor、control转染入THP-1细胞，以LPS刺激，使用荧光定量PCR，酶联免疫吸附实验(ELISA)等发放检测IL-6及TNF-α的表达。我们发现，胞内miR-302e的丰度发生了显著的变化(P值均小于0.01)。以100ng/mlL2S刺激THP-1细胞可以显著诱导IL-6和TNF-α的产生，而miR-302emimics和miR-302einhibitor则分别可以显著抑制和促进炎症因子IL-6和TNF-α的产生(P值均小于0.01)。　　 本部分研究说明miR-302e可以负向调节THP-1细胞经LPS刺激后释放炎症因子的能力。提示miR-302e可以负向调节固有免疫应答的因素，可能是PBC发病机制中的重要因子，具有潜在的治疗价值。　　 第三部分，PBC患者单核细胞对LPS刺激呈现高反应性　　 本部分我们使用LPS刺激PBC患者及健康对照者单核细胞，以荧光定量PCR及ELISA技术来检测炎症因子表达的改变。结果发现经LPS刺激后，PBC患者单核细胞IL-6及TNF-α水平明显高于经LPS刺激的健康对照组单核细胞(P值均小于0.001)。　　 这些结果表明PBC患者的单核细胞对LPS刺激呈现出高反应性。综上所述，本研究发现PBC患者单核细胞miR-302e表达下调，且这种表达下调可能是导致PBC患者单核细胞表现出明显“促炎”特性的原因之一。因此，miR-302e可能是PBC潜在的治疗靶点。　　 第四部分，IRAK4是miR-302e的靶点　　 前面的研究表明PBC可诱导miR-302e表达降低以及TNF-α和IL-6表达升高。并且miR-302e可负向调节LPS诱导THP-1细胞释放炎症因子的能力。为进一步研究miR-302e调控TNF-α和IL-6表达机制是否是通过TLR4途径完成的，在本部分的研究中，我们采用了TargetScan软件预测了miR-302e的靶基因，发现TLR4信号通路中重要因子IRAK-4是miR-302e的靶基因，随后，我们采用报告基因，荧光定量PCR，western等技术，进行了验证。　　 检测结果说明：IRAK4是miR-302e的靶基因，miR-302e可负向调节IRAK4的表达量，miR-302e通过IRAK4调节TLR4信号通路可能是造成PBC患者单核细胞功能异常的原因。　　 第五部分，siRNA沉默单核细胞IRAK4的表达可减弱LPS刺激导致的炎症因子的表达　　 在前面的实验中我们发现miR-302e可以负向调节炎症反应，而且发现miR-302e的调节作用正是PBC单核细胞功能亢进的原因，在第四部分中，我们证明了IRAK4是miR-302e的靶基因，但是miR-302e调节单核细胞对LPS反应性是否是通过IRAK4起作用目前尚不明确。在本部分研究中，我们采用siRNA技术沉默THP-1细胞上的IRAK4，通过荧光定量PCR及ELISA等方法检测沉默IRAK4后，炎症因子的表达情况。结果发现在转染IRAK4siRNA后，加LPS刺激THP-1细胞，于12小时后检测细胞内炎症因子的表达量，结果显示：IL-6及TNF-αmRNA水平明显低于阴性对照组。而培养基内的IL-6及TNF-α水平与细胞内表达量趋势一致(P<0.001)。　　 综上所述，提示miR-302e是通过IRAK4来负向调控固有免疫应答这一机制。PBC患者单核细胞功能异常的原因可能是miR-302e通过IRAK4调节TLR4信号通路造成的。提示miR-302e可能是PBC发病机制中的重要因子，具有潜在的治疗价值。