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DNA复制和转录过程产生的RNA/DNA杂交链,若不能及时被移除将产生严重的DNA损伤而破坏基因组的稳定性。RNase H2一种广泛存在于真核生物和原核生物中核糖核酸酶,可以通过断裂磷酸二酯键,有效地移除RNA/DNA杂交链中的RNA链,在DNA复制起始、转录过程中R-loop的移除、DNA的错配修复、冈崎片段中RNA引物的降解等过程发挥重要的作用。RNase H2包含保守的RNase H-fold,催化活性中心由四个保守的酸性氨基酸残基“DEDD”构成,催化反应的完成需要两个二价金属离子协助。 为了解金黄色葡萄球菌RNase H2与其他物种RNase H2之间的异同,我们解析了金黄色葡萄球菌RNase H2的晶体结构并通过体外生化实验对其功能进行了探索。在本论文的第一篇,我们体外重组表达并纯化了金黄色葡萄球菌RNaseH2,发现其在溶液状态下为二聚体,不同于其他原核生物RNase H2的单体状态。结构分析发现:金黄色葡萄球菌RNase H2与其他物种RNase H2的整体构象相似,均由氨基端RNase H-fold形成的催化核心和羧基端helix-loop-helix domain构成。然而,与其同源蛋白不同的是,金黄色葡萄球菌RNase H2在溶液和晶体中均以二聚体的形式存在。金黄色葡萄球菌RNase H2的二聚体结构显示,两个RNase H2亚基的活性中心均被彼此的羧基端结构域覆盖,呈现一种“自抑制”的状态。体外酶活实验结果显示,RNase H2二聚体依然可以催化不同种类RNA/DNA杂交链的水解,其催化效率在不同金属离子存在下具有显著差异,当Mg2+存在时,RNase H2具有更强的催化活性。根据结构分析和体外生化实验结果,我们推测:底物的加入诱导了RNase H2二聚体构象的变化,使其活性中心暴露并与底物结合进而发挥催化活性。 动粒是有丝分裂过程中组装在染色体着丝粒区域的巨大蛋白网络,分别由内层动粒CCAN网络(Constitutive centromere associated network)及外层动粒KMN蛋白网络构成。KMN蛋白网络由Knl1,Mis12复合物及Ndc80复合物组成。Misl2复合物通过与内层动粒蛋白CENP-C的相互作用与着丝粒相连,通过与Knl1及Ndc80复合物的相互作用与微管相连。Misl2复合物作为外层动粒的核心,对动粒复合体的装配以及染色体与纺锤体微管的正确连接至关重要。然而迄今为止,Misl2复合物与Ndc80复合物以及CENP-C的相互作用的分子机理仍不清楚。 在本论文的第二篇,我们表达、纯化了Mis12复合物,并通过结合实验验证了裂殖酵母、酿酒酵母中Misl2复合物与Ndc80复合物的相互作用。同时,我们克隆并表达了不同的Cnp3(裂殖酵母中的CENP-C的同源蛋白)截短片段,用以探索Misl2-Nnf1与Cnp3的相互作用,并进一步通过突变结合实验探索Cnp3在Misl2复合物上可能的结合位点。