论文部分内容阅读
第一部分：糖尿病状态下胰岛星状细胞活化加速目的：我们课题组在小鼠、大鼠和人的胰岛体外培养过程中均发现胰岛存在星状细胞外生现象,其细胞形态类似于胰腺星状细胞(Pancreatic stellate cell, PSC),但生物学行为略有不同,我们命名其为胰岛星状细胞(Islet stellate cell, ISC).近来研究提示其可能参与2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)胰岛纤维化的发生发展。本实验我们观察比较胰岛星状细胞在非糖尿病和糖尿病状态下活化程度的改变。方法：1,分离3月龄db/db糖尿病小鼠(C57BL/KsJ-db/db背景)及其野生型对照db/m小鼠(C57BL/KsJ-db/m背景)胰岛；2,分离、纯化、培养胰岛星状细胞：3,普通显微镜观察比较胰岛星状细胞外生速率；4,油红O染色观察比较星状细胞活化标志星状细胞胞浆内脂肪小滴消失速率；5,cck-8实验观察比较细胞增殖活力；6, Anextin-Ⅴ和PI凋亡实验观察比较细胞凋亡速率；7,划痕实验(Wound healing assay)和Transwell实验观察比较细胞迁移能力；8, q-PCR, Western blotting,免疫荧光染色(Immunofluorescence staining, IF)观察活化标志物平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)和细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)组份I型胶原(Collagen Type Ⅰ, Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Collagen Type, Col Ⅲ)、纤维连接蛋白(Finbronectin, FN)的表达；结果：1,小鼠胰岛分离后静置培养24小时,可见少许胰岛星状细胞自高糖高胰岛素培养的db/m小鼠及db/db糖尿病小鼠胰岛外生,并且随着培养时间延长,外生的星状细胞数量不断增加,db/m小鼠胰岛仅在48小时后见极少量星状细胞外生。2,油红O染色发现db/db小鼠及高糖高胰岛素培养环境中的db/m小鼠ISC胞浆内脂肪小滴消失速率较正常培养的db/m小鼠ISC明显加速,同时db/db糖尿病小鼠ISC在72小时后细胞体积扩大、形态展开成梭形,细胞胞浆内脂肪小滴完全消失。3,cck-8实验结果显不db/db小鼠及高糖高胰岛素培养环境中的db/m小鼠ISC的增殖活力在24小时后增加明显。4, Anextin-Ⅴ和PI凋亡实验显示db/db糖尿病小鼠ISC凋亡速率高于非糖尿病db/m小鼠ISC。5,细胞培养24小时后划痕实验和Transwell实验显示db/db糖尿病小鼠及高糖高胰岛素培养环境中的db/m小鼠ISC迁移能力快于非糖尿病胰岛星状细胞。6,q-PCR, Western blotting,免疫荧光染色观察a-SMA的表达结果提示,db/db糖尿病小鼠及高糖高胰岛素培养环境中的db/m小鼠胰岛星状细胞a-SMA的表达明显增加。7,q-PCR, Western blotting,免疫荧光观察db/db糖尿病小鼠ISC的细胞外基质组份Col Ⅰ,Col Ⅲ, FN的表达明显高于非糖尿病胰岛星状细胞。结论：我们的研究证实胰岛中存在星状细胞,其可能在糖尿病状态下通过快速的增殖、迁移、合成和产生过多的细胞外基质组份参与2型糖尿病胰岛纤维化的发生发展。第二部分：Regl蛋白抑制糖尿病胰岛星状细胞的活化目的：胰石蛋白／再生蛋白(Regenerating islet-dirived protein 1,Reg1)是胰腺组织在炎症、肿瘤及其它病理性损伤后胰腺自身分泌的应激蛋白,与胰腺损伤后的再生修复相关。糖尿病相关研究提示Regl蛋白可以促进90%胰腺切除实验性糖尿病大鼠胰岛的增殖再生。我们在前期临床研究中发现2型糖尿病患者血清中Regl蛋白的浓度较正常人明显升高,并且与糖尿病的病程及并发症的严重程度相关。本实验我们比较db/m小鼠及db/db糖尿病小鼠胰腺Regl蛋白及其受体EXTL3的表达,同时观察外源性重组Regl蛋白对ISC活化的影响。方法：1,苏木精—伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)法观察小鼠胰岛形态学改变。2,马松染色(Masson staining)鉴定小鼠胰岛纤维化情况。2,免疫组织化学(Immunohistochemistry staining, IHC)、q-PCR、Western blotting和免疫荧光技术观察小鼠胰腺组织、胰岛及ISCReg1蛋白及其受体EXTL3的表达；2,外源性重组Regl蛋白和胰岛星状细胞共培养24小时后观察胰岛星状细胞外生速率、胰岛星状细胞胞浆内脂肪小滴消失速率、胰岛星状细胞增殖活力、细胞凋亡速率、细胞迁移能力及细胞α-SMA和细胞外基质组份Col Ⅰ, Col Ⅲ, FN的表达。3, sh-RNA下调Reg1及其受体EXTL3的基因表达后,观察外源性重组Regl蛋白对胰岛星状细胞活化的影响。结果：1,小鼠胰腺组织切片HE染色提示：与db/m小鼠胰岛相比,db/db糖尿病小鼠胰岛体积增大,形态不规则。2,马松染色提示12周龄db/db糖尿病小鼠胰岛内及胰腺外分泌组织出现细胞外基质胶原纤维沉积,呈现纤维化改变,而相同周龄非糖尿病db/m小鼠胰腺未见明显马松染色阳性区域。3,小鼠胰腺组织免疫组织化学实验显示db/db糖尿病小鼠在12周龄时出现Regl蛋白及其受体EXTL3的表达,并且随着周龄的增加而逐渐增多。4,外源性重组Regl蛋白干预后,糖尿病胰岛星状细胞的外生数目减少、细胞胞浆内脂肪小滴消失的时间延长、细胞增殖活力和迁移能力减慢、细胞外基质组份Col Ⅰ, Col Ⅲ, FN的合成和分泌下降、凋亡水平无改变。5, sh-RNA下调Regl及其受体EXTL3基因表达后糖尿病胰岛星状细胞的活化水平增加。sh-RNA下调EXTL3的基因表达后,外源性重组Reg1蛋白对胰岛星状细胞的活化抑制作用消失。结论：我们的研究表明,糖尿病状态下Regl及其受体EXTL3的表达增加。Regl蛋白通过其受体EXTL3途径抑制糖尿病状态下胰岛星状细胞的活化。这些结果提示Regl蛋白可能通过对胰岛星状细胞活化的抑制作用进而延缓2型糖尿病胰岛纤维化的发生发展进程。第三部分：Reg1蛋白抑制糖尿病胰岛星状细胞活化的机制研究目的：糖尿病状态下胰岛星状细胞活化增加,Reg1蛋白可以抑制胰岛星状细胞的活化,但具体机制不明。本实验我们研究糖尿病状态下胰岛星状细胞迁移、增殖及细胞外基质合成和分泌等纤维化相关信号通路的改变及探讨外源性重组Regl蛋白对相关信号通路的影响及其机制。方法：1,分离,培养小鼠胰岛星状细胞。2, Western blotting技术检测db/m小鼠及db/db糖尿病小鼠胰岛星状细胞PI3K/Akt,MAPK/Erkl/2,TGF-β/Smad信号通路关键蛋白分子磷酸化的水平及外源性重组Regl蛋白和信号通路抑制剂对db/db糖尿病小鼠胰岛星状细胞PI3K/Akt,MAPK/Erk,TGF-β/Smad信号通路关键蛋白分子磷酸化的影响。结果：1, db/db糖尿病小鼠胰岛星状细胞的PI3K/Akt, MAPK/Erk1/2,TGF-β/Smad信号通路标志物磷酸化的Akt,Erk1/2,Smad2/3的表达明显高于非糖尿病db/m小鼠,TGF-β表达增加,Smad7表达减少。2,外源性重组Reg1蛋白干预后,糖尿病胰岛星状细胞PI3K/Akt,MAPK/Erk1/2,TGF-β/Smad信号通路Akt,Erk1/2,Smad2/3的磷酸化水平下降,Smad7的表达增加。sh-RNA下调EXTL3基因表达后Regl蛋白对PI3K/Akt, MAPK/Erk1/2信号通路关键分子磷酸化的抑制作用消失。sh-RNA下调EXTL3基因表达后Regl蛋白对TGF-β/Smad信号通路Smad2/3磷酸化的抑制作用仍然存在。结论：Regl蛋白通过对Regl-EXTL3-Akt, Regl-EXTL3-Erk和Reg1-EXTL3-TGF-β/Smad信号通路关键分子磷酸化水平的调控抑制胰岛星状细胞迁移、增殖和细胞外基质合成分泌。我们的结果提示,Regl蛋白可能通过对胰岛星状细胞纤维化相关通路关键分子磷酸化的影响进而延缓胰岛纤维化的发生发展进程。