目的：分子伴侣/引领蛋白(chaperone/usher, CU)通路是目前为止最普遍最具有代表性的菌毛装配途径,可以分为经典型、交替型和远古型三大家族,其中远古型CU通路分布最广,存在于许多重要的致病微生物和环境微生物中。黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)是一种土壤中的革兰氏阴性细菌,因其复杂的多细胞发育行为而成为研究原核生物发育的良好模型。前期工作中我们发现,黄色粘球菌远古型CU基因簇mcuABCD (MXAN3885-3882,其中mcuABC组成操纵子)参与孢子外壳蛋白的分泌,提示CU依赖性孢子外壳与菌毛的组装在进化上存在相关性。c-di-GMP[cyclic bis(3’-5’)diguanylicacid]是细菌体内重要的的第二信使分子,参与调节细菌的多种生理功能。本论文拟从环二鸟苷酸代谢酶候选基因入手,发现、鉴定粘细菌CU系统(Mcu)的调节因子,以完善远古型CU通路的调控机制,为阻断细胞表面粘附性致病因子的合成提供新思路。方法：1.RT-PCR检测c-di-GMP代谢酶候选基因在粘细菌发育阶段的表达情况；2.选择发育阶段表达的两个c-di-GMP代谢酶候选基因MXAN2424和MXAN5199,进一步通过报告基因分析它们的表达谱；3.通过同源重组构建MXAN2424和MXAN5199各自的敲除菌株;4.通过报告基因、Western blot等方法检测野生菌株和敲除菌株中mcuABC的表达,分析MXAN2424和MXAN5199是否为mcuABC的表达所必需;观察敲除菌株发育表型；5.高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)定量分析野生菌株和敲除菌株中c-di-GMP含量,结合定点突变、基因互补和纯化蛋白的酶学特性分析,初步判断MXAN2424和MXAN5199是否为c-di-GMP降解酶或合成酶。结果：1.RT-PCR显示,发育阶段表达的c-di-GMP代谢酶候选基因有MXAN2424、MXAN2807、 MXAN3705、MXAN4232、MXAN4675、MXAN5199、MXAN5340;2.报告基因进一步证实MXAN2424和MXAN5199在非发育及发育阶段均有表达；3.成功构建了两个基因敲除菌株△MXAN2424和△MXAN5199,两个敲除菌中mcuA的表达均延迟；从发育表型看,△MXAN2424细胞聚集无异常,而△MXAN5199细胞聚集晚于野生型大约18 h,且AMXAN5199细胞聚集时序与该菌株中mcuA的表达时序接近；4.在发育18 h和24 h时,AMXAN2424中c-di-GMP含量高于野生型,△MXAN5199中c-di-GMP含量低于野生型,提示MXAN2424和MXAN5199分别为c-di-GMP降解酶和合成酶；5.大肠杆菌表达纯化的MXAN2424蛋白可以水解磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)底物对硝基苯基磷酸酯[bis(p-nitrophenyl)phosphate,bis-pNPP],大肠杆菌磷酸二酯酶基因yahA能部分挽救△MXAN2424中mcuA的表达延迟,进一步提示MXAN2424具有c-di-GMP降解酶PDE活性,调节c-di-GMP水平并影响Mcu的表达；但MXAN2424中预测的与PDE活性相关的保守氨基酸(E59)突变后并不影响mcuA表达的时序和水平,推测仅突变一个氨基酸影响较小,或此酶蛋白活性中心不含谷氨酸；6. MXAN5199中预测的与c-di-GMP合成酶活性相关的保守氨基酸(E221)突变后并不影响mcuA表达的时序和水平,推测仅突变一个氨基酸影响较小,或此酶蛋白活性中心不含谷氨酸,或MXAN5199虽然为c-di-GMP合成酶,但其对mcuA的表达调节并不是通过影响c-di-GMP的水平实现的,即除作为c-di-GMP合成酶外,MXAN5199可能还具有其它功能。此外,MXAN5199蛋白FHA结构域保守氨基酸R55突变后延缓mcuA的表达,提示该结构域为mcuA及时表达所必需。结论：1.在粘细菌发育阶段有多个c-di-GMP代谢候选基因的表达；2. MXAN2424与MXAN5199均为Mcu及时表达所必需；此外,MXAN5199还为粘细菌正常发育所必需；3. MXAN2424具有磷酸二酯酶活性,通过影响c-di-GMP水平对粘细菌CU通路进行部分调节；4. MXAN5199可能具有c-di-GMP合成酶活性,MXAN5199对Mcu通路的调控可能依赖于MXAN5199对粘细菌发育的调控,MXAN5199对发育或Mcu通路的调控是否依赖c-di-GMP合成酶活性尚不能肯定。