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结核病(t,ubcrculosis，TB)是严重危害人类健康的全球性传染病。近年来，全球结核病疫情正在回升，结核病依然是一个严重的、需要高度重视的公共卫生和社会问题。异烟肼(isoniazid，INH)作为抗结核主要的一线药物，结核分枝杆菌对其耐药性的问题倍受关注。耐药结核分枝杆菌，特别是多重耐药结核分枝杆菌的增加，严重影响了结核病的治疗，给结核病控制带来了极大的困难。传统的药敏试验是建立在生物生长代谢过程中的表型上，这种方法所需时间长，通常为1～2个月，不能满足现代短程化疗的需求。近年来，随着分子生物学技术的发展，结核分枝杆菌的耐药机制逐步被阐明，尽管结核分枝杆菌耐异烟肼的分子机制尚未完全阐明，但至今研究结果均表明，INI耐药与结核分枝杆菌的KatG基因突变的联系最强，其中S315T位点的点突变是结核分枝杆菌耐异烟肼的主要原因。结核分枝杆菌KatG基因的编码序列(CDS)长度为2223bp，编码产物为过氧化氢酶一过氧化物酶。因此，建立一种对结核分枝杆菌耐药性的快速筛查方法，为尽快制定最佳治疗方案，防止耐药菌株在人群中的扩散，是临床需要迫切解决的问题。目前，针对KatG S315T位点进行检测研究的方法较多，如PCR-限制性片段长度多态性分析、PCR-单链构象多态性分析、直接测序法、双脱氧指纹图法、异源双链形成法、反向系列探针杂交法、DNA微阵列分析以及噬菌体生物扩增法等。这些方法或者由于技术的原因，存在假阴性、假阳性结果，或者需要较为特殊的仪器和试剂盒，试验费用较昂贵，很大程度限制了在临床实验室大规模推广使用。为此，本研究的主要目的为：建立以荧光实时PCR为基础的TaqMan荧光探针法快速检测结核分枝杆菌KatG S315T基因突变，探讨该方法能否作为临床上一种新的分子药敏试验方法，用于检测结核分枝杆菌对异烟肼的敏感性，为临床早期治疗提供快速而准确可靠的方法及依据，并评价其临床应用价值。
材料与方法：
菌株来源：103株实验菌株包括61株异烟肼耐药株(其中高浓度耐药株49株，低浓度耐药株12株)和42株异烟肼敏感株。42株异烟肼敏感株和大部分异烟肼耐药菌株均来源于江门市结核病防治所，部分异烟肼耐药株来源于广州市胸科医院，结核分枝杆菌标准菌株H37Rv(ATCC 27294)购自卫生部国家菌种保存中心。所有103株实验菌株均鉴定为结核分枝杆菌。
方法：应用荧光实时PCR TaqMan荧光探针法和DNA序列分析分别对临床分离的61株结核分枝杆菌异烟肼耐药株(其中高浓度耐药株49株，低浓度耐药株12株)和42株结核分枝杆菌异烟肼敏感株进行KatGS315T基因突变检测。将荧光实时PCR TaqMan荧光探针法结果与测序结果进行比较，评价荧光实时PCR TaqMan荧光探针法检测KatG S315T基因突变的准确度，分析KatG S315T基因突变与耐药的关系，并且与绝对浓度法(间接法)药敏试验结果进行对比，评价二者的一致性。
结果：
42株异烟肼敏感株DNA序列分析均没有检测到KatG S315T基因突变，在61株异烟肼耐药株中，检测到50株存在KatG S315T基因突变，1株存在Ser315Arg(AGC→AGA)的突变，1株发生Val319Asp(GTC→GAC)突变，突变率为85.2％(52／61)。其中高浓度耐药株中有46株检出发生S315T突变，1株发生Val319Asp突变，突变率为5.9％(47／49)；低浓度耐药株中有4株检出发生S315T突变，1株发生Ser315Arg(AGC→AGA)的突变，突变率为41.7％(5／12)，高浓度耐药株的基因突变率远高于低浓度耐药株的基因突变率(P<0.01)；42株异烟肼敏感株荧光实时PCR TaqMan荧光探针法检测均无KatG S315T基因突变，61株异烟肼耐药株中有49株存在KatG S315T基因突变，其中高浓度耐药株48株，低浓度突变株1株；荧光实时PCR检测KatG S315T基因突变的结果和测序法结果一致的有100株， 因此，与DNA序列分析相比，荧光实时PCR TaqMan荧光探针法检测的准确率为97.1％(100／103)。
荧光实时PCR TaqMan荧光探针法检测的灵敏度为80.3％(49／61)，阳性预测值为100％(49／49)，无假阳性结果；特异度100％，阴性预测值为77.8％(42／54)，假阴性率为19.7％(12／61)，103株实验菌株中，91株的检测结果和绝对浓度法(间接法)药敏试验结果相符合，符合率为88.3％(91／103)。
结论：
本研究采用荧光实时PCR TaqMan荧光探针法检测结核分枝杆菌KatG S315T基因突变，作为检测结核分枝杆菌对异烟肼敏感性的筛选方法。本研究证实，荧光实时PCR TaqMaln荧光探针法具有快速、特异性高、价格低廉、操作简便、重复性好等优点，实验进程可以在数小时内完成，与传统药敏试验相比大大缩短了实验室周转时间。因此，该方法适用于结核分枝杆菌对异烟肼敏感性进行大批量检测的初筛试验。