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研究背景 前列腺癌是男性中最常见的癌症,是西方国家男性癌症死亡的主要原因。2019年美国男性前列腺癌的发病率约为20%,死亡率约为10%。然而,近10年来,中国前列腺癌的发病率呈快速增长趋势。近年我们男性前列腺癌的发病率为3.35%,死亡率约为2.1%。由于国人开始接触西式饮食和生活方式以及环境因素的改变等,极大的加剧了我国前列腺癌的发病率。尽管目前针对局部前列腺癌的外科手术和放射疗法取得了一定程度上的成功,但是目前这些治疗方法的效果仍然有限,一旦患者进展为无法治愈的去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer,CRPC),总生存期将会明显下降。所以寻找新的前列腺癌的早期诊断和治疗的新的分子靶标仍具有非常重要的意义。Circ RNA是一类广泛存在于哺乳动物细胞中的内源性RNA,在基因表达调控中发挥着重要作用,但在前列腺癌中其分子机制尚不完全清楚。Circ HIPK3在不同的肿瘤组织中表达丰度不一样,在报道的大多数肿瘤中其均发挥了促进肿瘤作用,但在膀胱癌中却发挥着抑制肿瘤发展的作用。有文献报道其在前列腺癌中高表达,但迄今为止其在促进前列腺癌发生发展的具体作用机制尚未有详细报道。研究目的探讨 circ HIPK3在前列腺癌的发生发展中的生物学作用和具体作用机制。研究内容 (1)数据库筛选及前列腺癌组织验证前列腺癌中异常表达的circ RNA:首先根据数据库筛选在前列腺癌中异常表达的circ RNA,并用定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,q PCR)在前列腺癌及相应癌旁组织中验证,以确定最终选择的研究对象,即目标circ RNA。(2)目标circ RNA即circ HIPK3的鉴定及其在前列腺癌细胞中定位:根据数据库筛选及前列腺癌组织标本验证,确定研究Circ HIPK3。分别以前列腺癌细胞株(LNCa P,DU145,PC3细胞)的c DNA和g DNA为模板,利用divergent primer和convergent primer进行PCR以扩增出目的条带。同时将PCR产物进行Sanger测序确认splice junction,从而判断目标RNA是否为环状RNA。RNase R消化实验用来判断circ HIPK3是否可以耐受RNase R的消化,是否具有稳定性。荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)与核浆分离实验用以明确circ HIPK3在前列腺癌细胞中的定位。(3)体外细胞实验探讨circ HIPK3在前列腺癌中作用:CCK-8及克隆形成实验验证circ HIPK3对前列腺癌细胞株增殖的影响;流式细胞仪分析circ HIPK3对前列腺癌细胞株细胞周期和细胞凋亡的影响;Transwell实验和划痕分析circ HIPK3对前列腺癌细胞株的迁移和侵袭的影响。(4)体内实验验证circ HIPK3在前列腺癌中的作用:构建过表达circ HIPK3的载体,包装慢病毒并筛选稳转circ HIPK3的前列腺癌细胞株LNCa P,通过皮下注射将稳定过表达circ HIPK3的LNCa P细胞注入裸鼠颈背部皮肤下,观察肿瘤的生长情况。(5)探究circ HIPK3在前列腺癌中可以充当mi RNA的海绵:首先通过circular RNA Interactome数据库筛选circ HIPK3可能吸附的mi RNAs。通过RNA pull down技术确认在前列腺癌细胞株中目标circ HIPK3可吸附mi R-338-3p。Ago2-RIP实验,双荧光素酶报告基因实验和FISH共定位实验验证筛选的mi RNA与circ HIPK3之间存在相互作用。(6)筛选mi RNA调节的靶基因:经Star Base数据库筛选mi RNA可能调节的靶基因,结合从TCGA数据库中下载的前列癌差异表达基因的分析结果,并在前列腺癌组织中用q PCR验证。分别用q PCR和免疫印迹(Western blotting,WB)检测在前列腺癌细胞株中过表达或干扰circ HIPK3后靶基因的表达情况。(7)探讨circ HIPK3促进前列腺癌发展的机制:分别在前列腺癌细胞株中过表达或干扰circ HIPK3后加入相应mi RNA的抑制剂或模拟物,分别流式细胞分析细胞周期和凋亡的改变,q PCR及WB检测相应靶基因的改变。研究结果 (1)Circ HIPK3在前列腺癌组织和前列腺癌患者全血中均高表达,全血中高表达的circ HIPK3不但前列腺癌不良预后呈正相关,而且与血清中总前列腺特异性抗原(PSA)的水平以及患者的格林森分级(Gleason score)有关。同样,患者组织中circ HIPK3表达越高其Gleason score也越高。(2)Circ HIPK3由HIPK3的第二个外显子环化而成,在前列腺癌细胞株中成功扩增出circ HIPK3的全长,PCR结果经Sanger测序发现成功地扩增出circ HIPK3的splice junction。RNase R消化实验证实circ HIPK3可以抵抗核酸外切酶的消化,具有一定的稳定性。核质分离实验与FISH都证实其定位于前列腺癌细胞的细胞质中。(3)体外实验证实:circ HIPK3具有促进前列腺癌细胞的增殖,迁移和侵袭,抑制前列腺癌细胞的凋亡作用。(4)体内实验证实过表达circ HIPK3可促进肿瘤的生长。(5)Circ HIPK3在前列腺癌细胞中充当mi R-338-3p的海绵。(6)Circ HIPK3通过吸附mi R-338-3p从而调节其靶基因Cdc25B在前列腺癌中作用。(7)Circ HIPK3通过circ HIPK3/mi R-338-3p/Cdc25B轴促进前列腺癌细胞株的G2期向M期过渡。结论 Circ HIPK3在前列腺癌患者全血及组织中均高表达,全血中高表达的circ HIPK3不但前列腺癌不良预后呈正相关,而且与血清中总PSA的水平以及患者的Gleason score有关。而患者组织中circ HIPK3表达越高其Gleason score也越高。体外和体内实验证实circ HIPK3对前列腺癌的增殖,迁移,侵袭及凋亡相关。其充当mi R-338-3p的海绵,通过circ HIPK3/mi R-338-3p/Cdc25B轴促进前列腺癌细胞G2期向M期过渡,抑制细胞凋亡,从而促进前列腺癌的发展。