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细胞分裂素是一类重要的植物激素,参与众多生长发育过程,起着重要的生理调节作用,如抑制叶片衰老、吸引养分运输、参与顶端优势、打破芽的休眠、调节花及果实发育以及种子发芽等。另外,细胞分裂素还参与光调节的些生理过程,包括叶绿体分化、植物子叶扩张以及自养代谢的发育等。长期以来,虽然对细胞分裂素在遗传学、生物化学以及生理学等方面进行了大量工作,但对细胞分裂素糖基化修饰及其生理学意义的认识仍然有限。细胞分裂素糖基化修饰被认为是调控植物体内细胞分裂素代谢平衡的重要机制之一,是对细胞分裂素动态平衡进行精细调控的重要手段,这种调控与植物的生理状态、发育阶段、环境条件、生物和非生物胁迫等因素密切相关,对植物维持的正常生长发育起重要作用。糖基转移酶是专门负责催化这种糖基化反应的酶,它将活性糖基从核苷糖（nucleotide sugar）,通常是从尿嘧啶核苷二磷酸-葡萄糖（UDP-glucose）上将活化的葡萄糖残基转移到激素、次级代谢物、病原菌侵染物以及植物内外源毒性物质等一系列植物小分子化合物受体上。被糖基化修饰后的植物小分子往往会改变它们的生物活性、水溶性、稳定性、在细胞内和整体植株中的运输特性、业细胞定位以及与受体的相互识别与结合特性。细胞分裂素的糖基化修饰主要发生在嘌呤环和异戊烯侧链上,并且主要是添加葡萄糖。嘌呤环上的糖基化可发生在N3-,N7-和N9-位置上,分别形成了相应的N-糖苷。异戊烯侧链的糖基化主要发生在反式玉米素、顺式玉米素和二氢玉米素的-OH位置上,形成了相应的O-糖苷。在细胞分裂素糖基化修饰中,了解较多的是细胞分裂素O-糖基化,现已在多个物种,如烟草、玉米、拟南芥等中克隆出相关基因,在植物体外、体内研究了它们的功能。相比之下,对N-糖基化的认识仍然有限。虽然在以前的研究中通过离体生化的方法从拟南芥鉴定出了细胞分裂素的2个N-糖基转移酶基因UGT76C1和UGT76C2,但是它们在植物体内的催化性质以及生理学作用是什么,一直并不清楚。本论文总的思路是以体外生化实验获得的结果作为出发点,进而转向体内实验,以拟南芥这种模式植物作为实验材料,分析细胞分裂素的2个N-糖基转移酶基因UGT76C1、UGT76C2在植物体内所起的作用,确定它们在体内的细胞分裂素N-糖基化功能,分析这些基因的表达与内源细胞分裂素活性水平、与细胞分裂素相关基因表达以及与植物的细胞分裂素响应之间的关系,从而为深入理解细胞分裂素N-糖基化的分子基础及其功能基因表达的生理学意义提供依据。本论文主要的研究内容及结果如下：1.拟南芥糖基转移酶UGT76C1、UGT76C2在植物体内能够使细胞分裂素发生N-糖基化修饰、使细胞分裂素失活,并参与调控植物对细胞分裂素的响应构建了CaMV35S启动子启动的细胞分裂素N-糖基转移酶基因过表达植物载体,转化野生型拟南芥菜（Col-0）,筛选获得目的基因高表达的转化纯合体。筛选UGT76C1和UGT76C2的Salk T-DNA插入突变体（SALK144355和SALK135793）,获得了插入纯和突变体（ugt76c1和ugt76c2）。利用野生型拟南芥Col-0, UGT76C1、UGT76C2 T-DNA插入突变体和基因过表达体UGT76C1OE、UGT76C20E为材料,通过添加不同浓度的外源细胞分裂素6-BA,比较了它们在主根延伸抑制、侧根密度、叶片失绿、花色素苷积累等方面的差异。实验表明,突变体（尤其是ugt76c2）对外源添加的细胞分裂素较野生型敏感,而过表达体（尤其是UGT76C20E）较野生型不敏感,说明了UGT76C1、UGT76C2能将外源施加的细胞分裂素糖基化并使其失活,影响了植物对外源细胞分裂素的响应。尽管突变体和过表达体与野生型相比在正常生长条件下没有出现明显的表型变化,但我们注意到ugt76c2突变体的种子千粒重比野生型明显降低。我们测定了正常生长条件下的不同基因型植株体内细胞分裂素及细胞分裂素糖苷含量,发现尽管自由态的活性细胞分裂素总体水平没有发生明显变化,但在突变体中细胞分裂素N-糖苷含量显著降低,在过表达体中细胞分裂素N-糖苷含量显著升高,从而证明UGT76C1、UGT76C2基因在植物体内编码细胞分裂素N-糖基转移酶,在植物体内负责将细胞分裂素N-糖基化形成相对应的N-糖苷物。对野生型拟南芥Col-0,ugt76c1,ugt76c2突变体中与细胞分裂素代谢相关基因的表达进行了RT-PCR和Real-time PCR分析。结果表明突变体中,细胞分裂素受体基因（AHK2,AHK3）和细胞分裂素合成酶基因（IPT5）等基因的表达下调,而细胞分裂素氧化酶基因（CKX3,CKX4,CKX6）等基因的表达上调。这些结果反映了细胞分裂素N-糖基转移酶基因与其他细胞分裂素的相关基因共同调节着植物体内细胞分裂素的动态平衡。2.拟南芥糖基转移酶基因UGT76C1、UGT76C2的时空表达既有相似性又具特异性构建了UGT76C1和UGT76C2启动子与GUS基因的融合植物表达载体,转化野生型拟南芥菜（Col-0）,筛选获得转化纯合体后,分析这2个细胞分裂素N-糖基转移酶基因在拟南芥菜的不同组织细胞、不同发育阶段的表达变化。GUS组织化学染色实验表明,在4天之内的幼苗期,UGT76C1与UGT76C2在根、下胚轴、子叶中都有较强表达。但是在随后的生长发育阶段,UGT76C1的表达相对较弱,而UGT76C2在花序柄、花序、种子、根中仍有较强表达。通过Real-timePCR分析,UGT76C1与UGT76C2在不同组织和发育阶段的表达模式与GUS检测的结果基本一致。这些结果说明UGT76C1与UGT76C2在不同发育阶段、不同组织部位的表达,既有相似性又具特异性；另一方面,反映出这2个糖基转移酶的功能既相似又有所分化。3.拟南芥糖基转移酶UGT76C1、UGT76C2是细胞质定位酶构建了糖基转移酶基因UGT76C1、UGT76C2与GFP基因的融合表达载体,通过基因枪转化洋葱表皮细胞,观察了融合基因的瞬间表达情况。通过荧光显微镜观察,发现UGT76C1、UGT76C2与GFP融合蛋白定位于细胞质中,说明细胞分裂素N-糖基转移酶UGT76C1、UGT76C2是细胞质定位酶,它们对细胞分裂素的N-糖基化修饰作用发生在细胞质中。总之,本论文首次对细胞分裂素N-糖基转移酶基因UGT76C1、UGT76C2的活体功能进行了研究,证明了这2个基因在植物体内能够糖基化修饰细胞分裂素,形成对应的M糖苷。由于它们能将细胞分裂素糖基化失活,从而影响植物体内细胞分裂素的活性水平,改变植物对细胞分裂素的响应。同时,实验结果还说明N-糖基转移酶基因与其他的细胞分裂素相关基因形成了复杂的代谢调节网络,在体内共同控制着细胞分裂素的动态平衡。两个N-糖基转移酶是细胞质定位酶,它们在植物的不同组织与发育阶段的时空表达既有重叠性又有差异性。这些结果为我们深入理解细胞分裂素N-糖基化修饰的生理学意义奠定了重要的理论基础。