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猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)感染引起的严重制约我国养猪业发展的重要传染病。猪瘟弱毒疫苗具有良好的免疫效果和安全性,在猪瘟防控中发挥着至关重要的作用,但是该疫苗免疫猪群后缺乏有效的鉴别诊断手段,难以区分疫苗免疫动物和病毒感染动物,严重制约着规模化猪场猪瘟的防控与净化。因此,迫切需要研制有利于进行鉴别诊断的新型猪瘟标记疫苗。鉴于此,本实验旨在猪体水平系统评价猪瘟E2亚单位灭活疫苗的免疫保护能力,并通过杆状病毒表达系统表达猪的白细胞介素2(IL-2),评价其对猪瘟E2亚单位灭活疫苗的免疫佐剂效应。具体研究内容如下:1.猪瘟E2亚单位灭活疫苗的免疫效力评价利用本实验室构建的表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒Ac-3E2(F4代)感染sf9细胞,悬浮培养96h后收集样品,通过Western-Blot定量E2蛋白。进而将E2蛋白样品与等量ISA201佐剂进行乳化制备亚单位疫苗,使每头份(2ml)疫苗中E2蛋白含量为40μg,进而在本动物猪体上评价其免疫效果。以40 μg/头份的蛋白量免疫猪,20天后加强免疫一次,二免后14天使用猪瘟强毒株石门株攻毒,攻毒后14天进行剖杀。实验过程中,每天监测体温并观察猪的临床状态,同时检测免疫及攻毒后不同时间点血清中产生针对CSFV E2特异性抗体以及全血中CSFV拷贝数,在猪剖杀后观察各脏器及检测各脏器CSFV拷贝数等指标。试验结果显示:攻毒后猪瘟E2亚单位灭活疫苗免疫组猪只均没有出现体温升高和体表病变,精神状态和食欲方面良好。免疫后三周血清中产生针对E2蛋白ELISA抗体阻断率达70%以上;荧光定量RT-PCR检测结果表明攻毒后各时间点全血中未检测到猪瘟病毒的拷贝数;病理组织学观察免疫猪内脏器官均无病变。本实验结果表明猪瘟病毒E2蛋白制备的E2亚单位灭活疫苗都能保护猪抵抗猪瘟病毒强毒株的攻击,即诱导100%的保护性免疫反应。2.猪源IL-2对猪瘟E2亚单位灭活疫苗的佐剂效应研究为了进一步提高猪瘟E2亚单位灭活疫苗的免疫效果,探讨细胞因子佐剂IL-2对其是否具有免疫调节作用,利用杆状病毒表达系统构建表达猪源IL-2的重组杆状病毒Ac-2IL-2。进而通过western-blot方法定量IL-2的含量,与上述表达猪瘟E2蛋白的重组杆状病毒Ac-3E2的表达产物以及ISA201佐剂按照一定比例进行混合乳化制备亚单位疫苗,使每头份疫苗中E2蛋白和IL-2的含量分别为40μg和10μg,进而在兔体上评价IL-2对猪瘟E2亚单位灭活疫苗的佐剂效应。分为E2疫苗组、E2+IL2疫苗组以及商品化C株疫苗组,首次免疫21天后用同样方法加强免疫,一免后42天使用100 RID50的商品化细胞源C株疫苗毒株进行攻毒,攻毒后14天剖杀。实验结果表明:IL-2细胞因子佐剂的添加对于E2亚单位疫苗的产生没有明显的提高作用,抗体产生水平无显著差异;在细胞因子水平方面,添加IL-2细胞因子可以提高机体IFN-γ的表达量,但是对IL-4表达无促进作用。攻毒后除PBS组外,其他各组疫苗免疫组兔体的体温平稳,无定型热现象;荧光定量RT-PCR检测不同时间点血液中CSFV拷贝数结果显示,各个疫苗免疫组均没有检测到CSFV。结果表明在兔体上猪源IL-2对猪瘟E2亚单位灭活疫苗没有明显的免疫增强作用。