人的晚期糖基化终产物受体[human Receptor for the Advanced Glycation End product（hRAGE）]是一种细胞表面蛋白,属于免疫球蛋白超家族。hRAGE在胚胎发育过程中组成型表达,在整个生命周期中,其表达下调。hRAGE包含三个胞外结构域（一个可变结构域[V]和两个恒定结构域[C1,C2]）,一个单次跨膜螺旋结构域和一个C端的短胞质尾。其在免疫反应和多种病理情况中具有不利作用,比如心血管疾病、糖尿病、慢性炎症、神经退行性疾病和癌症。RAGE是一种具有多个配体的受体蛋白,它的配体有晚期糖基化终产物（AGEs）,高迁移率组蛋白1（HMGB1）,核酸和磷脂。当配体被受体的胞外区域识别后,受体通过胞内区域被活化,同时活化下游的信号通路。人的S100B蛋白是一种有名的RAGE配体,它可以高亲和力与V-C1结构域特异性结合,继而引发神经退行性疾病,炎症和癌症。因此,靶向hRAGE配体结合区域的特异性RAGE抑制剂可能在治疗与RAGE过度活化有关的疾病上具有临床价值。RAGE的胞外V结构域或者V-C1结构域是内源性和外源性配体的主要结合结构域。单结构域抗体,也称为纳米抗体,是一种存在于羊驼体内的只有重链的抗体,其具有一系列优势。本研究旨在获得靶向hRAGE的V-C1结构域的高亲和力纳米抗体,并将它作为一种潜在的治疗和诊断的工具。首先在大肠杆菌中过表达重组的V-C1结构域,将纯化的V-C1结构域通过肌肉注射到羊驼体内,产生V-C1结构域特异性纳米抗体。免疫完成后,成功构建噬菌体展示文库,获得三种具有潜力的纳米抗体,分别命名为3CNB,4BNB和5ENB,将它们连接到pET-22b载体中,并转化到E.coli,BL21中进行表达。进一步地,为了模仿IgG样分子,纳米抗体和人IgG1的Fc的C端融合,并用哺乳细胞表达载体pTT5在293F细胞中进行表达。纳米抗体-Fc融合蛋白分泌性表达,之后通过亲和柱与尺寸排阻色谱法（SEC）纯化纳米抗体,最终获得足量且纯的纳米抗体。通过尺寸排阻色谱法（SEC）,等温滴定量热法（ITC）,表面等离子共振（SPR）,圆二色谱（CD）以及DSS交联实验探索纳米抗体和V-C1结构域之间的相互作用。这些纳米抗体的Tm值高于75度,具有高的热稳定性。SEC结果显示所有的纳米抗体都能在溶液中与V-C1结构域结合,DSS交联实验也证实了它们可以相互结合。ITC结果显示,3CNB,4BNB和5ENB与V-C1结构域结合的解离常数分别是27.25 nM,39.37 nM和47.85 nM。SPR结果显示,人的IgG1-Fc介导抗体同源二聚化后,其与V-C1结构域的结合亲和力分别提升到0.55 nM,0.62 nM和0.41 nM,与V结构域的解离常数分别是1.09nM,1.61 nM和1.28nM。出乎意料地,我们发现这三种纳米抗体在hRAGE的V-C1结构域的识别位点互相竞争结合。表位作图结果阐明了纳米抗体与V-C1结构域的相对结合亲和力。此外,流式细胞仪结果显示所有带着Fc的纳米抗体都能够与表达在细胞表面的人的RAGE结合,这表明这些纳米抗体能够识别细胞表面天然的全长hRAGE蛋白。竞争性ELISA结果进一步证实这些纳米抗体对于hS100B和V-C1结构域的疏水相互作用具有中和功能,这为纳米抗体在RAGE相关疾病的治疗应用中提供了基础,未来的研究应该会建立RAGE动物模型,肺癌小鼠模型来评估我们的纳米抗体的抑制效果。而且,研究这些纳米抗体的药代动力学,效力,安全性和效率能帮助产生有效的RAGE相关疾病的治疗方法。我们推测这几种纳米抗体可能在作为治疗抑制剂上,以及与RAGE相关疾病的诊断试剂盒的发展上具有应用前景。