组织工程是应用细胞生物学和工程学原理，对病损组织结构和功能的修复与重建进行研究开发的一门新兴学科。其目的是研究和开发组织替代物。本研究对用组织工程方法再造骨组织进行了一系列的研究。 1．骨髓基质细胞成骨能力的实验研究 方法：体外分离、培养MSCs，观察其生长特点并进行碱性磷酸酶（ALP）组织化学染色；用矿化液连续培养，观察其骨形成能力。结果：倒置显微镜下观察，在矿化条件下，细胞传代培养5—6天后，长至铺满，细胞连续培养30天，Von-Kassa染色显示有局灶状钙盐沉积。结论：MSCs易于分离培养，体外扩增速度快，在矿化条件下，骨髓基质细胞在体外即具有很强的成骨能力，可以形成矿化结节。因而可以作为种子细胞，用于骨组织工程。 2．人血管内皮生长因子165真核表达载体的构建及鉴定 方法：利用基因克隆技术，将位于原核克隆载体pSP73上的目的基因VEGF₁₆₅克隆到真核表达载体pcDNA3.1上。将获得的真核表达质粒pcDNA3.1进一步用限制性内切酶酶切鉴定及基因测序，证明人VEGF₁₆₅基因正确克隆到pcDNA3.1真核表达载体上。 3．人血管内皮生长因子165基因转染骨髓基质细胞 方法：利用基因转移技术，将构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF₁₆₅通过脂质体介导转染SD大鼠骨髓基质细胞，然后以G418筛选阳性克隆，用免疫细胞化学方法鉴定。免疫细胞化学证实，重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF₁₆₅基因的表达。 4．骨髓基质细胞诱导培养后与磷酸钙陶瓷复合的实验研究 方法：分离的骨髓基质细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养，经矿化液诱导培养后分化为成骨细胞。将该细胞与预备处理后的磷酸钙陶瓷复合，通过细胞计数检测附着后的细胞生长增殖特性，并在扫描电镜下观察细胞 第四军医大学硕士学位论文在磷酸钙陶瓷表面的贴附情况。结论：磷酸钙陶瓷的生物相容性良好，细胞贴附后继续保持成骨细胞的表型，可以作为骨组织工程的支架材料。 5．基因转染的自体细胞与磷酸钙陶瓷复合异位成骨的研究 方法：成年雄性 SD大鼠 12只，全麻及无菌条件下取其左侧股骨、胜骨。将骨髓细胞接种入培养瓶中体外扩增培养，第sd开始用矿化液诱导培养持续1周，骨髓基质细胞向成骨细胞分化，诱导后的细胞行传代培养。l周后将骨髓基质细胞消化并在脂质体介导下进行VEGF；6s转染及G－418连续筛选 14d。然后将转染的和末转染的自体细胞混合一同接种于磷酸钙陶瓷上体外继续培养7d。最后将细胞一陶瓷复合体植入大鼠背部皮下和肌肉内。结论：应用以磷酸钙陶瓷为支架的VEGF165基因转染自体骨髓基质细胞种植，在组织工程骨周围有较多的血管形成，异位骨形成能力较好。