论文部分内容阅读
单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogens，单增李斯特氏菌)作为一种重要的食源性病原菌，能够引起严重的李氏杆菌病，具有较高的死亡率。传统的生理生化的检测方法步骤繁琐，耗费时间，不能达到快速检测单增李斯特氏菌的目的。因此，建立一种快速、灵敏、高效的检测单增李斯特氏菌的方法具有重要意义。
本研究建立了一种实时荧光单引物等温扩增技术(real-time fluorescence single primer isothermal amplification，RF-SPIA)快速检测鸡肉中单增李斯特氏菌的方法。本研究根据单增李斯特氏菌的hlyA特异性基因设计引物，可以通过荧光曲线法、荧光可视法或者沉淀可视法来判定检测结果。
对RF-SPIA方法的反应体系进行优化，确定反应总体系为25μL，其中包括:dNTPs(1.2mM)、2×Bca DNA聚合酶缓冲液(1.5μL)、5×RNase H酶缓冲液(1.5μl)、Mg2+(0.9mM)、核糖核酸抑制剂(RRI)(28U)、牛血清蛋白(BSA)(0.8mg/mL)、blocker(0.4μM)、DNA-RNA杂合引物(1.6μM)、Bca DNA聚合酶(22U)、RNase H酶(30U)、1∶300SYBR GreenⅡ荧光染料(1.0μL)、DNA模板(1.0μL)，最后用RNase-free water补足25μL体系。反应程序主要为:94℃预变性80s，61℃进行恒温扩增反应，所需反应时间为60min～90min，可根据扩增的具体情况终止反应。
本研究选取44株菌株对RF-SPIA方法的DNA-RNA杂合引物进行特异性验证。结果显示，14株单增李斯特氏菌均显示阳性结果，30株非单增李斯特氏菌均显示阴性结果。表明RF-SPIA方法特异性良好。
RF-SPIA方法的灵敏度通过检测单增李斯特氏菌的纯培养物得到。结果表明，荧光曲线法和荧光可视法的灵敏度为1.41×100CFU/mL，沉淀可视法的灵敏度为1.41×101CFU/mL。RF-SPIA方法的检出限通过检测人工污染的鸡肉样品得到，结果表明，荧光曲线法和荧光可视法的检出限为1.35×100CFU/g，沉淀可视法的检出限为1.35×101CFU/g。与传统PCR方法相比，荧光曲线法和荧光可视法的灵敏度比PCR方法的灵敏度(1.41×102CFU/mL)高出100倍，沉淀可视法的灵敏度比PCR方法的灵敏度高出10倍。荧光曲线法和荧光可视法的检出限比PCR方法的检出限(1.35×102CFU/g)低100倍，沉淀可视法的检出限比PCR方法的检出限低10倍。因此，RF-SPIA方法是一种特异且灵敏的快速检测方法。
应用RF-SPIA方法和国家标准方法(GB4789.30-2016)分别检测85份鸡肉样品，对RF-SPIA方法的敏感性、特异性和符合率进行评价。结果显示，国家标准方法(GB4789.30-2016)检测出6个阳性样品，RF-SPIA方法检测出8个阳性样品，得到RF-SPIA方法的敏感性、特异性和符合率分别为100％、97.46％、97.65％。表明RF-SPIA能够快速、特异、灵敏的检测鸡肉中的单增李斯特氏菌。
根据本研究数据可知，RF-SPIA方法可应用于检测鸡肉中的单增李斯特氏菌，该方法快速、简便、特异性高，对今后食源性致病菌的检测具有很好的应用前景。
本研究建立了一种实时荧光单引物等温扩增技术(real-time fluorescence single primer isothermal amplification，RF-SPIA)快速检测鸡肉中单增李斯特氏菌的方法。本研究根据单增李斯特氏菌的hlyA特异性基因设计引物，可以通过荧光曲线法、荧光可视法或者沉淀可视法来判定检测结果。
对RF-SPIA方法的反应体系进行优化，确定反应总体系为25μL，其中包括:dNTPs(1.2mM)、2×Bca DNA聚合酶缓冲液(1.5μL)、5×RNase H酶缓冲液(1.5μl)、Mg2+(0.9mM)、核糖核酸抑制剂(RRI)(28U)、牛血清蛋白(BSA)(0.8mg/mL)、blocker(0.4μM)、DNA-RNA杂合引物(1.6μM)、Bca DNA聚合酶(22U)、RNase H酶(30U)、1∶300SYBR GreenⅡ荧光染料(1.0μL)、DNA模板(1.0μL)，最后用RNase-free water补足25μL体系。反应程序主要为:94℃预变性80s，61℃进行恒温扩增反应，所需反应时间为60min～90min，可根据扩增的具体情况终止反应。
本研究选取44株菌株对RF-SPIA方法的DNA-RNA杂合引物进行特异性验证。结果显示，14株单增李斯特氏菌均显示阳性结果，30株非单增李斯特氏菌均显示阴性结果。表明RF-SPIA方法特异性良好。
RF-SPIA方法的灵敏度通过检测单增李斯特氏菌的纯培养物得到。结果表明，荧光曲线法和荧光可视法的灵敏度为1.41×100CFU/mL，沉淀可视法的灵敏度为1.41×101CFU/mL。RF-SPIA方法的检出限通过检测人工污染的鸡肉样品得到，结果表明，荧光曲线法和荧光可视法的检出限为1.35×100CFU/g，沉淀可视法的检出限为1.35×101CFU/g。与传统PCR方法相比，荧光曲线法和荧光可视法的灵敏度比PCR方法的灵敏度(1.41×102CFU/mL)高出100倍，沉淀可视法的灵敏度比PCR方法的灵敏度高出10倍。荧光曲线法和荧光可视法的检出限比PCR方法的检出限(1.35×102CFU/g)低100倍，沉淀可视法的检出限比PCR方法的检出限低10倍。因此，RF-SPIA方法是一种特异且灵敏的快速检测方法。
应用RF-SPIA方法和国家标准方法(GB4789.30-2016)分别检测85份鸡肉样品，对RF-SPIA方法的敏感性、特异性和符合率进行评价。结果显示，国家标准方法(GB4789.30-2016)检测出6个阳性样品，RF-SPIA方法检测出8个阳性样品，得到RF-SPIA方法的敏感性、特异性和符合率分别为100％、97.46％、97.65％。表明RF-SPIA能够快速、特异、灵敏的检测鸡肉中的单增李斯特氏菌。
根据本研究数据可知，RF-SPIA方法可应用于检测鸡肉中的单增李斯特氏菌，该方法快速、简便、特异性高，对今后食源性致病菌的检测具有很好的应用前景。