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由于日益严重的水体富营养化和全球气候变化,人类和动物暴露于蓝藻水华产生的蓝藻毒素（cyanotoxins）已成为一个日益严重的全球性问题。在蓝藻毒素中,微囊藻毒素（microcystins,MCs）是一类分布广、毒性大的环状七肽毒素,其具有肝毒性和促肿瘤活性,是最常见的,也是最危险的蓝藻毒素之一,这些蓝藻毒素是有效的肿瘤促进剂（IARC 2B类致癌物）。有流行病学研究表明,MCs是原发性肝癌（PLC）高发的危险因素之一。低剂量或高剂量的MC-LR的慢性或急性暴露可激活细胞凋亡途径,长期暴露于低浓度的MC-LR中会增加患癌症的风险。现有研究表明,micro RNAs（miRNAs）与很多毒物的毒性有关,在环境毒理学中受到了极大地关注。miRNAs的表达失调可能导致多种毒物相关疾病的发生。miRNAs可能参与许多生物学过程,包括细胞凋亡、免疫保护、神经系统发育和癌症发病机制等。此外,许多研究报告表明,miRNAs可能在细胞对MC-LR暴露的反应中发挥关键作用。但是在毒理学领域,关于miRNAs与MCLR毒性之间的关系还知之甚少。本研究选择通过高通量测序筛选与MC-LR肝毒性相关miRNAs,并通过生物信息学分析和预测目的miRNAs与MC-LR肝毒性的生物学过程以及信号通路的关系;同时,对筛选的目标miRNAs在MC-LR肝毒性中的表达以及作用的分子机制进行研究,以期揭示MC-LR致肝炎、肝癌的分子机制,并发现MCs毒性的分子生物标记物,为肝炎、肝癌药物靶点发现提供理论支持。本实验获得以下几方面的结果:（1）MC-LR暴露对白鲢肝脏miRNAs表达谱的影响为筛选MC-LR诱导的肝毒性作用中差异表达的miRNAs,本研究采用small RNA转录组测序分析的方法进行研究。高通量测序结果显示,在MC-LR（腹腔注射浓度为50μg/kg和200μg/kg）暴露白鲢24 h后,与对照组相比,处理组白鲢的肝脏分别有53个miRNAs和319个miRNAs的表达发生了显著变化。与50μg/kg处理组相比,200μg/kg处理组中白鲢肝脏203个miRNAs的表达显著上调,而163个miRNAs的表达下调。此外,本研究发现与对照组相比,MC-LR暴露可促进miR-2187-3p、miR-2779、miR-2478、miR-16、miR-144-5p、miR-181a-3p、miR-223、miR-451和miR-499的表达水平,而miR-146、miR-92、miR-203和miR-98的表达水平受到了抑制。本实验又进一步通过q PCR结果证实了以上结果,表明这些miRNAs可能与MC-LR的肝毒性有关。随后通过生物信息学针对差异表达的miRNAs通过靶基因预测软件进行靶位点确认,并对靶位点所在基因的GO功能注释以及KEGG pathway注释。GO富集分析表明,这些靶基因与代谢和细胞生物学过程相关。此外,KEGG通路分析表明,肝脏差异表达miRNAs的靶基因主要参与了胰岛素信号转导通路、PPAR信号转导通路、m RNA监测通路、Wnt信号通路和转录异常等途径。（2）MC-LR暴露对白鲢不同组织4个miRNAs表达的影响通过高通量测序结果分析,筛选出miR-16、miR-181a-3p、miR-223和miR-451这个miRNAs。因此,我们检测了这4个miRNAs在MC-LR暴露后白鲢不同组织（肝、脾、肾、肠）中的表达水平。检测结果发现,MC-LR暴露后白鲢肝脏miR-16、miR-181a-3p、miR-223和miR-451的表达水平升高。然而,在白鲢脾脏、肾脏和肠这些miRNAs的表达变化不同。这些结果表明,由于器官功能的差异,miRNAs的表达水平可能具有组织特异性。通过查阅相关文献结合本研究的实验结果发现,miR-16和miR-181a-3p可能协同参与了MC-LR诱导的肝脏炎症反应。同时,miR-223和miR-451可能成为MCLR肝毒性生物标志物;miR-223可能通过调控细胞周期变化参与了MC-LR的毒性作用,而miR-451可能通过调控多种信号通路参与了MC-LR的毒性作用。综上,我们推测这4种miRNAs可能参与了MC-LR对多器官的毒性作用,尤其是肝毒性。（3）miR-16在MC-LR致斑马鱼肝毒性中的表达及其可能的作用通过测序结果和分析,我们发现miR-16并选择其作为进一步研究的目的miRNA。对miR-16进行生物信息学分析,比对人和斑马鱼miR-16的成熟序列及其前体序列,发现其种子序列基本一致。此外,还比对众多物种miR-16的成熟序列,构建了系统进化树,发现miR-16在不同物种之间的保守性较强。研究了miR-16在MC-LR致斑马鱼肝毒性中的表达,结果表明miR-16可能参与调控MC-LR诱导的细胞周期、细胞凋亡以及炎症反应相关基因表达的改变,与MC-LR肝毒性相关,并可能在其中发挥调控作用。（4）MC-LR致HepG2细胞毒性中miR-16的表达及其作用研究通过利用人肝癌细胞HepG2细胞体外实验探究miR-16对MC-LR暴露诱导的HepG2肝细胞毒性、细胞凋亡和细胞周期改变的影响极其机制。首先探究了MC-LR暴露对HepG2细胞活力、细胞周期、细胞凋亡以及miR-16表达的影响,结果表明低剂量MC-LR可促进细胞活力,且低剂量MC-LR暴露（10μM）对HepG2细胞凋亡无影响,但会促进HepG2细胞G1/S细胞周期进程。miR-16表达的检测结果表明,低剂量MCLR暴露可抑制miR-16表达。因此,我们推测miR-16可能参与MC-LR诱导的细胞周期的改变。为了证实这一推测,本实验检测了miR-16过表达和表达抑制对MC-LR处理HepG2细胞活力、细胞周期、细胞凋亡及其相关基因和蛋白的影响。细胞活力检测结果表明,miR-16过表达抑制了MC-LR诱导的HepG2细胞活力,而miR-16抑制则促进了MC-LR引起的HepG2细胞活力。流式细胞仪检测的细胞周期结果表明,miR-16的过表达诱导了G0/G1期细胞的增加和S期细胞的减少。细胞凋亡检测结果表明,在MC-LR暴露后,miR-16的过表达或抑制作用不会改变HepG2细胞凋亡。通过q PCR检测细胞凋亡相关基因表达结果表明,miR-16可能不是通过调控Bcl-2参与细胞周期和细胞凋亡的过程变化,但可能通过调控Bax参与细胞周期进展的过程。此外,miR-16表达抑制下调了MC-LR处理的HepG2细胞中p53的表达,而miR-16的过表达上调了p53的表达。而且,P53蛋白质水平与m RNA表达水平一致,说明了miR-16可能通过调控p53参与了由MC-LR暴露诱导的细胞周期变化。有研究揭示miR-16家族通过同时沉默多个细胞周期基因而不是单个靶标来触发G0/G1细胞的积累。因此,结合本研究的结果有理由相信miR-16可能通过调节多个细胞周期基因（包括CDK6）参与细胞周期进程的改变。在本研究中,当miR-16过表达或抑制时,MC-LR处理的HepG2细胞PTEN和c-myc的表达也受到干扰。但是,miR-16与c-myc和PTEN之间的关系仍然不清楚,需要在以后的工作中进行研究。综合以上的结果证实,miR-16可能通过改变p53、CDK6、PTEN和c-myc的表达参与MC-LR致HepG2细胞周期调控。本研究的主要结论:（1）miRNAs可能在MC-LR肝毒性中发挥重要的调控作用。筛选出4种miRNAs（miR-16、miR-181a-3p、miR-223、miR-451）,与MC-LR肝毒性相关。（2）MC-LR暴露后,4个miRNAs（miR-16、miR-181a-3p、miR-223、miR-451）在白鲢肝脏、脾脏、肾脏和肠中表达发生了改变,其表达具有组织特异性。（3）miR-16在不同物种之间有较强的保守性;miR-16可能与MC-LR诱导的斑马鱼肝脏细胞周期、细胞凋亡以及炎症反应的改变相关。（4）低剂量MC-LR暴露可促进HepG2细胞活力,并抑制细胞凋亡相关基因的表达。MC-LR暴露还诱导miR-16表达的下调。进一步的研究表明,过表达miR-16可通过改变P53、CDK6、PTEN和c-Myc的表达而抑制MC-LR暴露引起的HepG2细胞细胞周期的改变。这些结果提示,miR-16可能对MC-LR诱导的细胞周期改变有调控作用。