基于杂交链式反应的荧光信号放大策略在沙门氏菌检测中应用的研究

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沙门氏菌(Salmonella)是一种广泛存在于肉类、牛奶、鸡蛋和蔬菜等食品中的食源性致病菌,该菌被欧洲疾病预防与控制中心列为世界上第二大的食物中毒元凶,现已被报道的Salmonella有2500多种血清型,其感染人类症状表现为恶心呕吐、腹痛腹泻、头痛发热等,建立快速灵敏的检测方法实现对该菌的有效监控具有重要意义。基于杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)的荧光信号放大方法因操作简单、特异性强、灵敏度高,受到研究者们的广泛关注。本研究构建了基于HCR的荧光生物传感器,实现了对食品中Salmonella快速灵敏的检测,为我国食源性致病菌的监测体系提供了新的技术手段。各章内容分述如下:第一章综述了核酸杂交介导的荧光信号放大方法在生物检测中应用的研究进展。第二章建立了两种基于HCR和磁珠的新方法用于检测Salmonella,该方法通过生物素标记的DNA探针(bio-probe)将不对称聚合酶链式反应(Asymmetry polymerase chain reaction,aPCR)获得的目标单链DNA(Single stranded DNA,ssDNA)搭载于标记有链霉亲和素的磁珠表面(Streptavidin-magnetic beads,SA-MBs),ssDNA触发两个DNA发夹探针(H1/H2)发生HCR,形成SA-MBsssDNAH1H2n复合物,并通过荧光基团修饰和荧光染料标记两种方式实现荧光信号输出。本章分别采用倒置荧光显微镜对两种方法的可行性进行了验证,并对两种方法的重要参数进行了优化,在最优条件下,两种生物传感器对PBS中Salmonella的最低检测限达到101 CFU/mL,对食品基质中Salmonella的最低检测限达到102 CFU/g或102 CFU/mL,且表现出良好的特异性。第三章建立了基于HCR结合氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)的均相荧光检测方法,用于快速、灵敏和特异地检测Salmonella。本研究通过聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、PCR产物纯化和高温变性三步获得ssDNA,并根据ssDNA序列设计了一对以ssDNA为引发链的6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,FAM)修饰DNA发夹探针,利用GO对ssDNA和dsDNA亲和力差异及其荧光淬灭特性成功建立了一种均相荧光检测方法。本章优化了GO浓度、GO孵育时间和HCR时间等重要参数,在最优条件下,该方法可成功地用于Salmonella的检测,其对PBS中Salmonella的最低检测限为4.2×101CFU/mL,对牛奶中Salmonella的最低检测限为4.2×102 CFU/mL,且具有良好的特异性。
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