淇河鲫H2A与Ca-L-hipposin克隆和特征分析及其对细菌感染的表达响应

来源 :河南师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:repopw
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目前,水产养殖中抗生素的广泛使用,导致病原微生物耐药性的提高,抗生素富集与残留,从而给水产品安全和人类健康带来风险。寻找高效、安全、广谱新型抗菌制剂替代传统抗生素迫在眉睫。抗菌肽是潜在的抗生素替代品,耐高温,具有广谱的抗菌活性,而且病原微生物不易产生耐药性。目前抗菌肽已经在医学、畜牧养殖和食品保鲜等领域开始使用。到目前为止,已经报道的抗菌肽有1000余种,大多为两亲性阳离子α-螺旋结构抗菌肽,而鱼类抗菌肽的研究相对较少。本研究基于GenBank中登录的H2A保守区域,采用Primer5设计组蛋白H2A简并引物。以淇河鲫(Carassius aurutus in Qihe River)肌肉提取总RNA为模板、采用RT-PCR方法克隆H2A编码区序列,通过胶回收和连接到载体,然后转化到JM-109大肠杆菌中进行克隆测序,最后成功获得组蛋白H2A编码区序列364bp。采用相同方法克隆青鱼(Mylopharyngodon piceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)和鳙(Aristichthys mobilis)组蛋白H2A基因序列。在线软件分析发现均属于不稳定点蛋白质,平均亲水性范围为-0.179~-0.264,PI值范围为10.48~11.02。用DNAman分析淇河鲫、青鱼、草鱼、鲢和鳙组蛋白H2A编码区基因同源性达到93%,氨基酸同源性达到99%。淇河鲫、青鱼、草鱼、鲢和鳙基因与狭孔金线鲃(Sinocyclocheilusangustiporus)同源性达92%,同斑马鱼(Danio rerio)同源性为83%。相比较五种鱼氨基酸与狭孔金线鲃同源性为98%,同斑马鱼同源性为91%,与其他物种的同源性偏低。淇河鲫、青鱼、草鱼、鲢和鳙H2A N-端第2~52位(除去第1位甲硫氨酸)与庸鲽(Hippoglossus hippoglossus)hipposin抗菌肽51个氨基酸相对应,同源性极高。庸鲽hipposin抗菌肽不存在任何酸性氨基酸,为带15个正电荷的碱性抗菌肽,但是淇河鲫、青鱼、草鱼、鲢、鳙第1位的半胱氨酸被丝氨酸取代,第41位的组氨酸被谷氨酸取代,,显示其电荷量为+14的阳离子,空间结构模型显示为α螺旋结构抗菌肽。用ExPaSy里的切割工具预测该淇河鲫组蛋白H2A可以被胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和嗜热菌蛋白酶等52位水解成短肽,第1位的甲硫氨酸可以被胰凝乳蛋白酶水解和溴化氰试剂去掉。这51个氨基酸恰好对应于庸鲽抗菌肽hipposin,经过克隆验证将其命名为Ca-L-hipposin抗菌肽。青鱼、草鱼、鲢、鳙在该位点也可被相应的蛋白酶切割产生类hipposin抗菌肽。说明淇河鲫、青鱼、草鱼、鲢和鳙组蛋白H2A N-端可衍生类hipposin抗菌肽。克隆获得淇河鲫组蛋白H2A开放阅读框ORF序列387bp,共编码128个氨基酸,3’-UTR非编码长度为466bp,具有AATAAA的多聚腺苷酸终止信号位点,5’-UTR非编码长度为55bp,全长共908bp。淇河鲫组蛋白H2A属于阳离子α螺旋抗菌肽,其空间结构同大西洋鲑(Salmo salar)、虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)、斑马鱼的组蛋白H2A空间结构相似性达到96%。为组蛋白H2A基因及衍生类hipposin抗菌肽基因深入研究提供了分子基础。采用实时荧光定量RT-PCR技术,检测淇河鲫在以下八个组织:肝脏、肾脏、脑、脾脏、鳃、心脏、肌肉、肠中mRNA表达水平,结果显示在淇河鲫8个组织当中,组蛋白H2A mRNA表达在肾脏表达量最高,脾脏次之,其次为鳃、脑、肝脏,其中表达量较少为肠道和心脏,肌肉中表达量最少。采用实时荧光定量RT-PCR技术,采用2-ΔΔct方法分析淇河鲫腹腔注射嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)诱导表达组蛋白H2A和Ca-L-hipposin抗菌肽变化。嗜水气单胞菌攻毒淇河鲫后,组蛋白H2A和抗菌肽Ca-L-hipposin在肝脏、脾脏和肾脏组织表达明显上调(P<0.01**)。将两者表达量做散点图,通过拟合曲线分析,结果显示呈正相关性,说明两者对嗜水气单胞菌的感染具有明显的响应,而且两者表达变化较为一致,说明Ca-L-hipposin的表达并不是独立于H2A的表达,推测抗菌肽Ca-L-hipposin是由组蛋白H2A经酶水解而来。另外,Ca-L-hipposin对细菌感染响应敏感,说明Ca-L-hipposin在鱼类免疫和抗病中扮演重要角色。通过基因工程生产,有望在渔业生产上成为一种潜在的抗菌药物。
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