前言 先天巨结肠(Hirschsprung’s disease，HD)基本病理特点是病变肠管肌间和粘膜下神经丛神经节细胞缺如，副交感神经节前纤维大量增生、增粗、排列紊乱，即内源性神经缺乏，外源性神经增生。近年来对Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICCs)的研究说明其缺失是HD等多种肠运动性疾病的原因之一。肠神经系统(enteric nervous system，ENS)三维结构复杂，既往对其观察主要采用石蜡切片染色方法，是局限在平面上的，只能部分地显示神经节细胞、胶质细胞及间质细胞的形态，并与其初始位置方向有关。本研究目的是通过肠管整体封藏标本制备(whole-mount preparation，WMP)，然后结合免疫组织化学方法标记神经组织，来观察HD的肠神经支配及ICCs整体分布，为HD等肠神经发育异常疾病的研究探索新思路。 材料与方法 临床根治手术中获得30例普通型HD标本。男25例，女5例，平均10月(3月～7岁)。保留全部手术切除标本，根据HE染色检查神经节细胞情况以及肠管大体形态确定正常段、扩张段、移行段和狭窄段用作自身对照。标本用Zamboni氏液(4％ Paraformalin，0.2％Picric acid，0.1M PBS，pH7.3，900 mOsm)固定。沿邻近肠系膜侧边缘取2cm×2cm肠壁全层组织块。在解剖手术显微镜用显微手术镊子、剪子完成WMP。将制备好的粘膜下层和纵行肌层样品固定标本在一种自行制备载玻片上。标本样品在染色前用0.3％Triton X-100孵育12 hours，兔抗人鼠S100(1：500)及c-kit(1：500)多克隆抗体免疫组织化学染色(Strept-Avidin-Biotin-complex，SABC法)，做第一抗体阴性对照。用光学显微镜观察肌间和粘膜下神经纤维和ICCs的形态与分布并采集照片。结果 采用本实验固定标本方法，标本收缩程度小，在WMP操作分离容易。经HE检查分段准确，利于确定ENS在HD整体表现。免疫组化染色前用TritonX一100和复合消化酶处理标本使抗原暴露而利于染色。对SABC法染色步骤进行调整，增加第一抗体总量，降低浓度，延长反应时间，使背景染色低，目标染色强。本实验采用的自制玻璃硅胶载玻片适合于肠管WMP标本的染色操作。HD肠管正常段、扩张段、移行段和狭窄段等各段肌间及粘膜下神经纤维5100均表达，呈棕黄或棕褐色;c一ht在HD正常段及扩张段肠管呈阳性，而狭窄段则为阴性，免疫组化染色阴性对照无染色，此染色法可用于WMP肠标本神经丛和IcCs的标记来观察它们整体形态和分布。 HD正常段结肠肌间和粘膜下层存在较丰富神经节细胞，5100免疫组化:纵行肌和环行肌之间有均匀分布的神经纤维和神经节细胞集簇，神经纤维均匀一致无粗大改变，分支互相交织成竹篓样结构;粘膜下层隐窝周围有均匀的神经纤维网;C一kit阳性ICCs胞体及其突起形成筛网。狭窄段肌间和粘膜下层无神经节细胞。纵行肌层内面存在粗大神经束沿肠管纵轴方向走行，扭曲紊乱，分支少而不均匀，分支之间互相联系少;粘膜下层陷窝周围无均匀神经网络;肌间c一kit阴性。移行段肌间和粘膜下层存在少量神经节细胞，肌间和粘膜下神经纤维仍粗大，但分支增多，互相联系增加。扩张段与正常段相近，只是由于肠管扩张而较分散。结论 1 .WMP结合免疫组织化学是观察ENS及ICCs三维结构的良好方法。为ENS生理和病理基础研究提供了新思路。 2.自制的硅胶载玻片适用于胃肠道WMP标本染色操作，且简便易得。 3.HD的痉挛段与正常段肠神经丛神经纤维整体形态存在显著差别，肌间神经神经纤维由正常段向狭窄段逐渐变得粗大分支减少，正常粘膜下陷窝周围有均匀的网状结构，而狭窄段则不存在这样的网状结构。 4.HD正常段肌间层c一kit阳性的ICCs胞体与突起互相交织呈网状分布，狭窄段c一垃染色阴性，不存在ICCs网络，这直观反映了Cajal间质细胞与先天巨结肠发病有关。