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目的动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种常见的血管病变,其特点是动脉血管壁炎症的发生和脂质斑块的形成。目前认为,AS是血脂、血糖和炎症等危险因素与遗传易感基因相互作用的结果。随着遗传学研究手段的发展,传统的基因调控模式已经很难完全解释心血管疾病和环境变量之间的互作关系。心血管疾病中的表观遗传调控作用越来越受到关注。表观遗传学指在不改变核苷酸序列的情况下,调节基因转录。表观遗传调控是基因与环境相互作用的桥梁,DNA甲基化是目前研究最明确也是最广泛的表观遗传标记。近年研究证实,全基因组DNA甲基化程度与AS发生密切相关。局部DNA高甲基化调控通过改变AS调控相关基因表达参与了AS发生及演进,但具体的作用靶点和作用机制仍然不十分清楚。E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)是转录相关调控因子,是从子宫颈内膜癌Hela细胞cDNA文库中克隆出来。本实验室前期研究发现,CREG是重要的组织和细胞分化稳态调控因子。CREG在人正常血管内皮细胞中高表达,而CREG在AS血管内皮细胞中的转录和翻译水平表达均显著降低。我们进一步研究证实,过表达CREG基因能够对抗AS发生,但其下调的分子机制一直未阐明。我们应用生物信息学软件分析发现,人CREG基因的第一外显子区存在大量的CpG岛,提示DNA甲基化可能参与AS血管内皮细胞中CREG基因表达的调控。基于以上研究结果,我们提出科学假说,CREG基因通过调控DNA甲基化参与AS的发生。因此,本研究以DNA甲基化调控为切入点,探讨在AS独立危险因素氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,OX-LDL)刺激下,CREG在人原代脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中表达下调的甲基化调控机制,并为AS的防治提供新的理论基础和治疗靶点。方法(1)采用OX-LDL和DNA甲基转移酶抑制剂(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)分别作用于原代培养的HUVEC,通过Western blot和定量PCR检测CREG、甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)的表达。初步确定人CREG基因表达与甲基化的相关性。(2)通过生物信息学软件预测分析明确人CREG基因启动子区的CpG岛的位置;通过构建CREG启动子区荧光素酶报告基因载体并进行基因表达活性检测分析,明确CpG岛对CREG基因表达的调控作用及具体调控区域。(3)应用OX-LDL增加原代培养HUVEC细胞甲基化水平,应用5-Aza-CdR抑制原代HUVEC甲基化表达后,提取HUVEC基因组DNA,进行焦磷酸测序,以明确CREG基因启动子区关键CpG岛甲基化位点。进一步通过构建含CREG基因关键CpG岛甲基化突变位点的荧光素酶报告基因载体和荧光素酶活性检测,明确具体的甲基化位点对CREG基因表达的调控作用。结果(1)应用不同浓度的OX-LDL(50μg/mL和100μg/mL)作用原代HUVEC,Western blot和定量PCR检测CREG和DNMTs的表达。结果显示:随着OX-LDL浓度的增加,DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在RNA和蛋白水平表达均显著增加,CREG表达减少。将不同浓度的5-Aza-CdR(10μM、50μM和100μM)作用原代HUVEC细胞抑制DNMT1、DNMT3a、DNMT3b表达后,CREG转录及表达显著增加。以上结果提示:人CREG基因转录表达与HUVEC甲基化水平负性相关。(2)通过生物信息学软件预测发现,人CREG基因的第一外显子区存在明显的CpG岛(-48/+588)。进一步应用含有不同启动子片段的荧光素酶报告基因载体活性检测证实,CpG岛对CREG表达呈负性转录调控作用,其中+79/+255为关键负性转录调控区。(3)分别应用OX-LDL(50μg/mL和100μg/mL)和5-Aza-CdR(10μM、50μM和100μM)作用于原代HUVEC后,行CREG启动子+79/+255区域的焦磷酸测序。结果发现,经过OX-LDL处理后,CREG基因关键CpG岛甲基化水平较对照组增加,而经过5-Aza-CdR处理后,CREG基因关键CpG岛甲基化水平较对照组减少。以上结果表明,OX-LDL促进CREG基因启动子区CpG岛(+201/+255)片段的甲基化水平增高。随后,分别构建+201/+255片段中8个CG位点突变的荧光素酶报告基因载体并行荧光素酶活性检测分析。结果证实,CREG基因启动子区的关键甲基化调控位点为+201/+202。综上所述,CREG基因启动子区甲基化变化影响CREG基因的表达,关键的甲基化调控位点为+201/+202。结论在OX-LDL作用下,CREG基因启动子区局部CpG岛高甲基化,下调CREG表达而导致AS的发生。这可能是AS始动阶段,内皮细胞中CREG蛋白缺失的关键调控机制之一。