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前言 1型糖尿病是由于胰岛β细胞的自身免疫损伤而引起胰岛素分泌绝对不足所致。患者必须采取胰岛素替代疗法。现代的分子生物学和细胞生物学发展为治疗1型糖尿病灌注了新的思想。通过将可表达的胰岛素基因直接导入体内组织或将体外构建的胰岛素分泌细胞移植入患者体内，有望达到根治糖尿病的目的。 肝细胞是除胰岛细胞外唯一含有葡萄糖感应器(Glut2及GK)的体细胞，而且许多肝脏特异性基因都受生理性葡萄糖的调控，所以其作为1型糖尿病基因治疗的靶细胞越来越受到人们的关注。同样，肝癌细胞也是胰岛素表达载体转染的理想细胞。正常情况下，胰岛素在胰腺β细胞分泌颗粒中加工成成熟胰岛素时，需要前激素转化酶PC2和PC3的作用。肝癌细胞内不含有PC2和PC3，不能有效地加工胰岛素原，故不能分泌成熟的胰岛素。但肝癌细胞内富含成对碱基氨基酸蛋白酶furin，能识别鼠类胰岛素原的Arg-X-Lys-Arg序列，为此将此序列引入人胰岛素原cDNA的B-C、C-A结合点，再导入肝癌细胞就可以在furin的作用下分泌成熟的胰岛素。 本实验采用逆转录病毒作为携带胰岛素基因的载体，经脂质体包裹导入体外培养的肝癌细胞HepG2。G418筛选出阳性细胞克隆，提取克隆细胞的染色体DNA，行PCR扩增，用电泳检查转入基因情况。另外，用放射免疫分析方法监测培养液胰岛素水平，探讨胰岛素基因的表达情况。为下一步构建表达调控载体和动物实验奠定基础和提供实验数据。 实验材料 一、主要试剂 脂质体（LIPOryCTAM…XG418（Genehcin入DMEM（Ddsecco’s modsed Eede’s n：leQllllll）培养基均购自美国 GIBCOBRL公司。PCR试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。 二、实挪备 24孔或6孔组织培养板上5nd和eend培养瓶JOCm和6——培养皿、冻存管和离心管问京华美公司＊o 培养箱；超净工作台；美国PERKIN－ELMER PE9700 DNA扩增仪；MINI－SUBTMCELL水平电泳仪（Bi。－Rad八小型台式离心机（SIGMAI－13h低温高速离心机（美国SORVALL ST－ZI人 实验方法 二．含有突变人胰岛素原基因逆转录病毒载体一质粒PLXSN－MpINS的提取。 采用碱裂解法制备质粒4龙州一MpINS，紫外吸收检测 DNA浓度与纯度。 2．脂质体介导质粒 PLXSN－MP鹏转染肝癌细胞 HePGZ。 转染前24 ／J’时，将 HePG以 5 X 10’接种于6孔培养板（各孔直径为35nun人第2天，用脂质体转染法用u将对x派和4山倒一MPINS质粒转染到上述HePGZ细胞中，并分为未转染组，空载体转染组和胰岛素原基因转染组。37℃，5％的COZ培养至72 ，J’时。 3．G418筛选阳性细胞克隆 转染后72小时，除了第二孔外加G418（终浓度为300 dd ·2·dX每日观察细胞生长情况且每隔两天更换一次培养液和G418（终浓度为300pgilnl人转染后2周，各孔出现不同的阳性细胞克隆，分另将其转移至两个25ml培养瓶中继续培养来提取细胞染色体DNA。 4．细胞样品的收集和检测 转染前后收集细胞培养液，将样品送内分泌实验室检测胰岛素水平。 5．细胞染色体DNA的提取 用Trizol法分别从未转染的HepGZ细胞，转染空载体的pLX－SN和转染PLXSN－MPINS质粒的阳性细胞克隆中提取细胞染色体DNA。 6．PCR扩增及电泳鉴定 反应体系 50pl，循环条件：96℃变性 2分，94℃变性 30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环后，72℃延伸5分。用1％琼脂糖凝胶检测 PCR产物。 实验结果 1．G418筛选阳性克隆 未转染质粒且未加 G418的细胞生长良好。未转染质粒但加G418的细胞转染后7天内均凋亡。转染质粒pLXSN－MpINS细胞在加G418筛选后细胞状态依旧良好。 2．人胰岛素原基因在肝癌HepGZ细胞染色体DNA整合水平的检测 PCR扩增及电泳鉴定显示人胰岛素原基因转染成功。 3．人胰岛素原基因在肝癌细胞中表达水平的检测 胰岛素基因转染组与未转染组、空载体转染组比较细胞外的胰岛素水平有明显差别师＜0．of人 ·3· 讨 论 二型糖尿病患者体内胰岛素绝对缺乏，若能在患者的胰腺外组织建立呈生理模式调控的胰岛素分泌，则是治疗二型糖尿病非常理想的方法。很多学者在此方面做了有益的探索，但是在基因转移载体、靶细胞的选择和表达调控等方面，还有很多问题需要解决。 胰岛素的合成是以前体形式存在，在运输途径中经翻译后加工成为成熟的胰岛素，而切除C肽所需的PCZ和PC3是胰岛素原转变和代谢的限制性内肽酶。人肝癌细胞内不含有PCZ和PC3，故不能有效地加工胰岛素原。但肝癌细胞内富含成对碱基氨基酸蛋白酶fuin，能识别鼠类胰岛素原的吃一X－Lys一吨序列，为此将此序列引人人胰岛素原CDNA的B－C人一A结合点，再导人肝癌细胞就可以在uin的作用下分泌成熟的胰岛素。 本实验采?