柞蚕抗菌肽attacin-like基因的鉴定及其免疫功能研究

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柞蚕(Antheraeapernyi)作为鳞翅目绢丝昆虫,具有重要经济价值的同时,也是一种良好的模式生物。抗菌肽(Antimicrobialpeptides,AMPs)是昆虫体液免疫防御中的重要免疫因子。本文从柞蚕中克隆了一个抗菌肽attacin-like基因,并探讨了其在不同病原体刺激后的表达模式及其重组蛋白体外的抑菌活性和细胞毒性。研究结果如下:1.克隆出柞蚕Ap-attacin-like基因,该基因全长cDNA为702 bp,编码233个氨基酸,该基因包含一个17个氨基酸的信号肽序列,该蛋白去除信号肽后的预测分子量为23.64 kDa。柞蚕attacin-like的二级结构包含6.87%螺旋结构、14.16%线型结构和78.97%的环型结构。其中该蛋白序列与日本柞蚕attacin序列相似度最高,相似度达到97%;2.在大肠杆菌E.coli中利用Pet-32a质粒重组表达出分子量大小为43 kDa的融合蛋白。利用Ni-NTA亲和层析纯化得到重组蛋白,并用新西兰大白兔制备了抗Ap-attacin-like多克隆抗体;3.Ap-attacin-like在五龄3天柞蚕幼虫血细胞、表皮、脂肪体、马氏管、中肠和丝腺中都有表达,且在血细胞和脂肪体中表达较高;4.对五龄3天柞蚕幼虫分别注射白僵菌(Beauveria bassiana)、大肠杆菌(Escherichia coli)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和柞蚕核型多角体病毒(Antheraeapernyi nuclearpolyhedrosis virus,ApNPV),然后检测被四种微生物侵染后不同时间段脂肪体中Ap-attacin-like在mRNA和蛋白水平的表达变化情况。四种微生物侵染刺激后Ap-attacin-like的mRNA和蛋白水平的表达量均有不同程度的上调;5.Ap-attacin-like重组蛋白对大肠杆菌具有明显的抑菌作用,测得的最小抑菌浓度MIC50为200 μg/mL,而对金黄色葡萄球菌没有抑菌效果;6.Ap-attacin-like重组蛋白在浓度200μg/mL时对兔血细胞有一定的毒性。
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