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目的:制备载紫杉醇(Paclitaxel,PTX)-胆固醇复合物脂质体(Paclitaxel-Cholesterol complexes liposome,PTXL),探讨其对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(Human keloid fibroblasts,HKFs)增殖、侵袭、凋亡及周期的影响,及PTX对瘢痕疙瘩中Akt/GSK3β表达和纤维化的影响,并建立裸鼠皮下瘢痕疙瘩种植瘤模型,考察PTXL对肿瘤生长的抑制作用。方法:(1)通过薄膜-超声分散法制备载PTXL;(2)采用单因素考察和正交实验方法对PTXL处方进行优化;(3)采用动态光散射法(Dynamic Light Scattering,DLS)、透射电镜法(Transmission electron microscope,TEM)和高效液相法(High Performance Liquid Chromatograph,HPLC)对其粒径分布、Zeta电位、外观形态、载药量、包封率、体外释放及30日内稳定性和渗漏率进行考察;(4)采用香豆素6(Coumarin 6,C6)代替PTX制备C6L,以流式细胞术和激光共聚焦实验检测HKFs对PTXL的摄取速度及其机制;(5)采用细胞增殖抑制试验(CCK-8)对脂质体材料的细胞毒性进行评价,并检测PTXL对HKFs增殖的抑制作用;(6)采用细胞划痕实验检测PTXL对HKFs平面迁移能力的影响;(7)Transwell实验检测PTXL对HKFs侵袭能力的影响;(8)流式细胞术检测PTXL诱导HKFs凋亡情况和对细胞周期的影响;(9)采用酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)检测正常人皮肤成纤维细胞(Normal human skin fibroblasts,NFs)和 HKFs 中 TNF-α、IL-6 和 TGF-β 表达差异及 PTX 对 HKFs 中上述细胞因子表达的影响;(10)通过免疫印迹试验(Western Blot,WB)检测PTX对HKFs中Akt/GSK3β通路和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)表达影响;(11)通过皮下接种HKFs方法建立裸鼠皮下瘢痕疙瘩模型,考察PTXL在体内抑制瘢痕疙瘩生长作用;(12)通过苏木精和伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining,HE)观察瘢痕组织结构和内脏组织有无病理变化,TUNEL染色观察瘢痕疙瘩组织凋亡情况;(13)通过免疫组织化学技术(Immunohistochemistry)检测PTX治疗后瘢痕疙瘩组织中AKT/GSK3 Β通路和α-SMA、Collagen I 表达变化。结果:(1)PTXL 的制备方法为:取磷脂 30 mg,其中 SPC:EPC=8:1,DSPE-mPEG2000为4 mg,PTX-CHOL 1.5 mg,CHOL 1 mg加入三氯甲烷3 mL溶解,40℃水浴条件下100 rpm/min转速旋蒸蒸发40 min,使药物和材料在圆底烧瓶内壁形成一层均匀半透明薄膜,加入5%葡萄糖溶液2 mL使脂质膜充分溶胀水合,冰水浴条件下超声波细胞粉碎仪超声15 min(功率65 W,超声2 s,间歇1 s),即得PTXL混悬液,采用0.22 μm水膜过滤3次,得PTXL溶液,外观为清澈透明的无色液体。(2)TEM下PTXL为外观圆整、大小均一的球形结构,平均粒径为(101.43±0.54)nm,PDI 为(0.244±0.006),Zeta 电位为(-41.63±0.83)mV,说明脂质体颗粒大小适中,分布均一,表面带有较高的负电荷,有利于脂质体溶液的稳定。(3)PTXL包封率为(95.63±0.70)%,载药量为(2.70±0.16)%,PTXL体外释放实验中从6 h开始可以检测到药物的释放,释放量逐渐增加,72 h释放药量可达投药量的51.21%,对药物具有缓慢和持续释放作用;30日内PTXL粒径无明显变大,1、7、15、30 日渗漏率分别为(0.13±0.05)%、(4.35 ± 1.93)%、(8.74±0.06)%和(18.23 士 0.98)%,药物渗漏率较低,稳定性良好。(4)细胞摄取实验发现:HKFs中荧光强度分别为:孵育15 min后C6和C6L组分别为(103.22±6.00)和(550.96 ± 22.73),孵育 30 min 后 C6 和 C6L 组分别为(861.33±47.37)和(3756.34±373.86),摄取量随时间延长逐渐增多(P<0.01),相同时间下HKFs对C6L的摄取明显高于C6(P<0.01),并且HKFs对C6L的摄取可以被小窝蛋白内吞抑制剂甲基-β-环糊精(M-ββ-CD)抑制59.9%,而不能被网格蛋白内吞抑制剂氯丙嗪(CPZ)抑制;(5)CCK8实验表明:当药物浓度低于1μg/mL,脂质体材料(Blank-L)48 h内对HKFs活性的抑制低于5%,市售PTX溶剂(无水乙醇+聚氧乙烯蓖麻油,E+EL)48 h内对HKFs活性的抑制低于15%,当药物浓度高于1 μg/mL时,相同浓度下,Blank-L的细胞毒性低于市售PTX溶剂(P<0.05或P<0.01)。且PTX对HKFs活性抑制呈时间和剂量依赖性,相同浓度下,PTXL对HKFs的抑制作用明显高于PTX(P<0.01);(6)细胞划痕实验表明:PTX和PTXL可明显延缓划痕愈合,抑制细胞向划痕部位迁移,并且使细胞密度减低;(7)Transwell实验结果显示:HKFs具有较强的侵袭能力,而PTXL组的侵袭率为对照组的(5.77±4.10)%,明显低于PTX组的(28.21±7.95)%(P<0.01)。(8)在细胞凋亡实验中,作用24 h后对照组、PTX组和PTXL组的凋亡比例分别为(4.59±0.94)%、(33.92±0.58)%和(44.42 ± 1.31)%,PTX组和PTXL组细胞凋亡比例明显高于对照组(P<0.01),其中PTXL组又高于PTX组(P<0.01)。(9)细胞周期检测发现,PTX和PTXL作用24 h后HKFs G2/M期细胞比例从对照组的(14.60±3.48)%分别增加到(78.90±5.32)%和(87.15 ± 1.17)%(两两比较,均P<0.01);(10)ELISA 实验结果表明,HKFs中TNF-α、IL-6和TGF-β的表达明显高于NFs,并且HKFs中高表达的细胞因子可以被PTX所抑制,PI3K/Akt抑制剂LY294002也可以抑制HKFs中上述细胞因子的表达;(11)动物实验表明,PTX和PTXL可明显抑制瘢痕疙瘩的生长,治疗结束后瘤体积和瘤重与对照组相比有显著差异(P<0.05或P<0.01),PTXL组对瘢痕疙瘩的抑制效果优于PTX组(P<0.05),HE染色可见治疗组瘢痕疙瘩内细胞密度有所降低,各内脏组织内未见器质性变化,且TUNEL染色发现PTX和PTXL可诱导瘢痕疙瘩组织凋亡;(12)通过Western Blot和免疫组化检测HKFs和瘢痕疙瘩组织中蛋白表达情况发现,PTX可抑制瘢痕疙瘩中α-SMA和Collagen I的表达改善疤痕疙瘩纤维化,并且该作用与抑制Akt/GSK3 β通路的表达有关。结论:1.制备的PTXL有效改善了 PTX的水溶性,粒径适中,大小均一,带有负电荷;2.PTXL对PTX具有缓释作用,稳定性好,渗漏率低;3.PTXL可抑制HKFs增殖、迁移、侵袭能力,并且可将细胞周期阻滞于G2/M期和有效诱导细胞发生凋亡;4.通过HKFs皮下接种法可成功建立瘢痕疙瘩动物模型,PTXL诱导瘢痕疙瘩组织内细胞凋亡从而抑制瘢痕疙瘩体内生长;5.PTXL可明显增加PTX对瘢痕疙瘩的体内外治疗效果,具有较高的安全性;6.PTX可以通过抑制HKFs中Akt/GSK3 β通路发挥抑制炎症因子TNF-α、IL-6和TGF-β表达的作用,并且抑制瘢痕疙瘩的纤维化。