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在众多影响动物繁殖的环境因素中,内毒素(Endotoxin)感染和热应激(Heat stress)是两个非常重要的方面。内毒素化学本质是脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)。LPS和热应激都能够通过多种路径对动物机体造成不良影响,本研究着重探讨二者对动物繁殖产生的不良影响。已有研究结果证明,LPS或热应激作用于活体动物时,均能显著抑制生殖内分泌轴,抑制激素分泌、发情、排卵,降低受胎率和活胎率等。卵泡颗粒细胞(Granulosa Cell)是一种高度分化的体细胞,与卵母细胞关系密切,在动物繁殖活动中发挥重要作用,而关于LPS和热应激对颗粒细胞的直接影响及作用机理仍缺乏深入了解。因此,本研究以离体培养的猪颗粒细胞为模型,旨在探讨LPS和热应激对颗粒细胞形态、增殖、凋亡和激素分泌功能的影响,并对作用路径进行初步研究。经过前期预实验确定LPS实验处理时间为48 h,热应激处理实验为3 h。利用扫描电子显微镜分别放大1000×、5000×、10000×和15000×观察LPS或热应激对细胞形态产生的影响。在LPS对颗粒细胞增殖、凋亡和雌激素分泌影响的研究中,利用CCK8测定细胞增殖情况;利用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒借助流式细胞仪检测细胞凋亡情况;利用ELISA法测定培养液中E2含量,利用Western Blot检测细胞MAPKs蛋白含量,包括ERK、Phospho ERK、JNK、Phospho JNK、p38、Phospho p38 MAPK;利用qRT-PCR检测与细胞增殖周期相关的基因FN1、IGF2、IGFBP2、Cyclin D1、Cyclin D2和P27kip的表达。针对LPS和热应激对颗粒细胞功能的影响检测了基因P450arom、FSHR的表达。同时检测了HSP70基因的表达,研究发现,LPS和热应激都能够激活颗粒细胞HSP70基因,使这两个环境不良因素对动物繁殖影响产生交汇点,因此利用小分子物质HSP70抑制剂(VER 155008)和HSP70激活剂(STA-4783)针对HSP70作相应处理,随后分别检测三个基因的表达和HSP70蛋白的表达。并在HSP70过表达的基础上利用Western Blot和细胞免疫荧光染色实验对Phospho Smad3进行了定量和定位。结果显示LPS处理后,细胞饱满,有较多微绒毛发和伪足,细胞状态和活力均优于对照组。1000 ng?mL-1浓度LPS即可显著促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、提高活细胞百分率(P<0.05),而500 ng?mL-1 LPS即可促进与细胞生长增殖、周期相关基因FN1(P<0.01),IGF2、IGFBP2(P<0.05),Cyclin D1、Cyclin D2(P<0.01)的表达,抑制阻碍细胞周期的基因P27kip(P<0.01)的表达。细胞MAPKs蛋白含量中,各总蛋白含量不变,各磷酸化蛋白含量增加。热应激处理使细胞固缩,微绒毛及伪足消失,细胞状态比对照组差。LPS和热应激均可强烈抑制芳香化酶P450arom和FSHR基因的表达(P<0.01),LPS刺激还能够显著抑制E2的分泌(P<0.01)。LPS和热应激均可在转录和反应水平上显著地上调HSP70基因的相对表达量(P<0.01)。经HSP70抑制剂(VER155008)处理后,HSP70基因相对表达量代偿性上调,蛋白表达量被抑制。P450arom和FSHR基因的相对表达量显著回调(P<0.01)。在应用HSP70激活剂(STA-4783)后,HSP70基因被极显著激活(P<0.01),基因相对表达量增加超过50倍,蛋白表达量显著上调。P450arom和FSHR基因的表达与前者相反,出现极显著下调。HSP70过表达3 h和48 h均能明显抑制Smad3磷酸化和向核转移,核内荧光变暗,且Phospho Smad3蛋白量显著降低。以上结果表明,LPS可以促进颗粒细胞增殖并抑制细胞凋亡,LPS和热应激抑制颗粒细胞功能。二者对颗粒细胞激素分泌功能的影响是通过HSP70实现的,HSP70阻碍Phospho Smad3的核转移是其发挥作用的路径之一。