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【目的】肝细胞肝癌(hepatpcellular carcinoma,HCC)是发生于肝脏的,常见的发病率极高的消化系统恶性肿瘤之一,其高复发、高转移是主要特征。许多因子和表观遗传变化均与HCC形成密不可分,其中包括长链非编码RNA(lncRNA)。lncRNA是一类不具备编码蛋白能力的长度超过200 nt的非编码内源性RNA分子,可以在多种层面调控基因表达,广泛参与生物体各种生理及病理过程。至今,已有大量研究揭示了许多lncRNAs参与到人类疾病进程中,尤其是癌症。为了探究lncRNA在HBV相关的肝癌发生发展中的作用,我们利用深度测序技术筛选出一个在HBV阳性的HCC组织中异常高表达的新的lncRNA分子Unigene56159。本研究拟解析Unigene56159在肝癌细胞中异常表达的调控机制,并探寻其对肝癌细胞体外生长、迁移和侵袭等恶性行为的影响及作用机制,从而阐明Unigene56159在肝癌发生发展过程中的具体作用机制及可能的调控网络。这将有助于我们深入理解HBV感染诱导的lncRNA在肝癌发生发展中的作用。【方法】首先,通过RT-qPCR方法检测HBV阴性和HBV阳性的HCC组织以及肝癌细胞系中Unigene56159的表达情况。此外,瞬时转染表达HBV各编码蛋白的质粒到HepG2和Huh7细胞中,通过RT-qPCR方法检测Unigene56159的表达情况。进一步利用细胞功能学实验包括Transwell迁移和侵袭实验、平板克隆形成实验、MTT实验分析Unigene56159对肝癌细胞HepG2和Hep G2.2.15恶性行为的影响,并结合Western blot实验检测Unigene56159对EMT的分子标志物E-cadherin及Vimentin蛋白水平的影响,以评价Unigene56159对EMT进程的影响。为了解析Unigene56159的具体作用机制,我们利用生物信息学方法预测靶定Unigene56159的候选miRNA,并运用EGFP荧光报告载体实验、RT-q PCR方法证实了Unigene56159是miR-140-5p的直接靶基因并受其负性调控。随后,我们进一步探究了miR-140-5p对肝癌细胞Hep G2.2.15和HepG2的生长以及迁移、侵袭行为的影响;此外,生物信息学软件预测了miR-140-5p下游的靶基因Slug,用EGFP荧光报告载体实验、RT-qPCR及Western blot实验证实了miR-140-5p可以直接靶定Slug使其表达下调;最后,用RT-qPCR及Western blot实验检测了Unigene56159对Slug的竞争性调控,EGFP荧光报告载体实验检测了Unigene56159对Slug的调控是否是依赖miR-140-5p。【结果】RT-qPCR实验结果表明Unigene56159在HBV阳性的HCC组织中表达上调。此外,Unigene56159在HBV阳性细胞系Hep G2.2.15细胞中表达水平明显高于HBV阴性细胞系Hep G2;转染HBV复制型质粒pHBV1.3后Huh7细胞中Unigene56159的水平明显高于对照组。这一数据进一步验证了我们深度测序的结果。HepG2和Huh7细胞转染HBx的表达质粒后,Unigene56159表达水平升高,表明HBV自身编码的X蛋白诱导了Unigene56159的高表达。细胞功能学实验表明Unigene56159能够促进肝癌细胞的迁移和侵袭能力及EMT进程,但对肝癌细胞活性及体外增殖能力影响不明显,在肝癌细胞中扮演着癌基因的角色。利用生物信息学方法及EGFP荧光报告载体实验和RT-qPCR方法证实Unigene56159是miR-140-5p的直接靶基因并受其负性调控。而miR-140-5p能够抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力及EMT进程,同样也不影响肝癌细胞的活性及体外增殖能力。进一步生物信息学预测及EGFP荧光报告载体实验证实miR-140-5p直接靶定Slug并负性调控其表达。并且我们进一步证实,在肝癌细胞中,Unigene56159能够正向调控Slug的mRNA和蛋白水平。最终证实了Unigene56159是通过依赖miR-140-5p的方式来调控下游靶基因Slug的表达发挥其促癌作用。【结论】本研究发现一个在HBV阳性的HCC组织中异常高表达的新的lncRNA分子Unigene56159,并证实了其受HBx蛋白的调控。功能学实验表明Unigene56159通过与Slug共同竞争结合其上游调控因子miR-140-5p促进肝癌细胞的迁移和侵袭行为,从而在肝癌细胞中发挥着促癌基因的作用。