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传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）是禽传染性支气管炎(infectious bronchitis，IB)的病原体，可引起鸡急性、高度接触性传染病，持续威胁着世界养禽业的健康发展。本研究制备了IBV非结构蛋白5和10(nsp5和nsp10)的单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb），并以原核表达的重组蛋白GST-nsp5为包被抗原，建立了间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA）检测方法，用于IBV血清抗体的检测。 利用原核表达系统，在体外重组表达IBV肾型毒株SC021202 nsp5和nsp10的基础上，以纯化的重组蛋白His-nsp5和His-nsp10为免疫原分别免疫BALB/c小鼠，取免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，结合ELISA、IFA和Western blot技术，应用有限稀释克隆法筛选能分泌有效抗体的杂交瘤细胞株。结果各获得了2株分别针对nsp5(1E2，2B10)和nsp10(1G2，3G7)的mAb分泌细胞。Westernblot分析显示针对nsp5和nsp10的杂交瘤细胞株分泌上清均与各自对应的蛋白有良好的特异性反应;IFA检测显示所制备的mAb与不同组织嗜性的IBV毒株的细胞适应毒均具有较好的反应性。IBV nsp5和nsp10 mAb的制备为IBV的监测和鉴别以及进一步了解非结构蛋白的功能奠定了基础。 以重组表达的GST-nsp5融合蛋白为抗原，建立了检测IBV抗体的间接ELISA方法。通过对ELISA反应条件的优化，确定了最佳反应条件:抗原包被浓度为3.64μg/ml;包被液为0.01 M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4);待检血清1∶200稀释;酶标抗体1∶1000稀释;10％新生牛血清/PBS为封闭液;含0.05％吐温-20、5％脱脂奶的PBS为样品稀释液;待检血清反应时间为60min，酶标二抗反应时间为45min，底物反应时间10min。以S/P值等于0.12作为IBV抗体阴、阳性血清判定的临界值。特异试验表明:ELISA检测抗原不与禽流感病毒、新城疫病毒和传染性法氏囊病毒等阳性血清发生交叉反应。同批抗原制备的不同检测板变异系数(CV)值在3％-16％之间，不同批抗原制备的检测板CV值在7％-19％之间。本方法与间接免疫荧光试验相比，阳性符合率为93.11％、阴性符合率为95.38％、总符合率为93.33％;与进口IBV ELISA检测试剂盒(IDEXX)相比，阳性符合率为98.11％，阴性符合率为95％，总符合率为97.62％。应用所建立的nsp5 ELISA检测人工接种IBV后鸡血清抗体消长规律评估了该方法用于检测IBV血清抗体的有效性。SC021202强毒株感染组在接种后6天即可检测到nsp5抗体，持续时间至少为147天。M41灭活苗和H52弱毒苗免疫组nsp5抗体转阳相对于感染组出现时间较晚，分别为接种后9天和12天，其中M41灭活苗免疫组的nsp5抗体持续时间最短，在接种77天后抗体水平逐渐降低，并在98天后转阴;H52弱毒苗免疫组在接种91天后出现nsp5抗体水平的逐渐下降，并在接种后133天转阴。通过和IDEXX IBV ELISA试剂盒对IBV血清抗体检测结果的比较显示，三个实验组在实验观察期内的绝大部分时期的nsp5抗体和IBV抗体的消长规律相似，说明本研究所建立的nsp5 ELISA血清抗体检测方法能够体现IBV接种后真实的抗体变化规律，可用于IBV接种后的血清学检测。此外，本研究所建立的nsp5 ELISA是首次报道的以IBV非结构蛋白作为检测抗原的IBV血清学检测方法，该方法所用的IBV SC021202毒株nsp5蛋白和Genebank上登陆的70株IBV参考序列的氨基酸同源性为88.3％-99.7％，其相对于结构蛋白具有更高的保守性，具有检测不同血清型IBV抗体的潜力。上述结果表明，本研究所建立的IBV抗体间接ELISA检测技术具有高度的特异性和敏感性，具有作为一种快速、可靠、有效的IBV抗体临床检测方法的潜力。