目的:本实验主要分为三个部分,第一个实验主要探讨瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经保护的作用,观察MCAO术后,在6h、24h、72h、7d、14d较长时间段神经功能缺损的情况及瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠脑梗塞体积及脑组织细胞形态学的影响,同时与经典的艾灸治疗,以及NK-κ B抑制剂NAC及NAC联合神火灸做对比;第二部分观察瑶医神火灸对氧化应激、炎症、细胞凋亡相关指标的影响;第三部分探讨瑶医神火灸是否通过介导NF-κ B炎症通路起神经保护作用及相关机制研究。方法:对于整体的动物实验方案:(1)使用线栓法进行阻塞大脑中动脉(MCAO法)建立实验大鼠缺血再灌注损伤动物模型,缺血2h,再灌注24h,观察大鼠行为学,使用Zea-longa评分法观察大鼠神经功能缺损评分情况,评价造模是否成功。将实验大鼠采用随机数字法分为六组:假手术组、模型组、神火灸治疗组、艾灸治疗组、NAC组、神火灸+NAC组;治疗组采用神火灸、艾灸治疗,NAC采用脑室注入方法干预,(1)观察不同时段(6h、24h、72h、7d、14d)神经功能评分;(2)TTC法检测脑梗塞体积;(3)HE染色观察脑组织切片的形态学变化;(4)尼氏染色观察神经元损伤情况;(5)氧化应激相关生化指标的检测:于14d采集大鼠外周血,取血分离血清,ELISA法观察血清中MDA、SOD活性情况;(6)于14d采集大鼠外周血,取血分离血清,ELISA法观察血清炎症因子TNF-α、IL-1、IL-10的表达情况;(7)观察各组TUNNEL细胞凋亡情况;(8)采用免疫组化法、Western Blotting法、qPCR法测各组NF-κ B通路相关蛋白(Cox-2、iNOS、NF-κ B/p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3),确定瑶医神火灸治疗对相关通路蛋白和下游凋亡因子的影响。结果:1、瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠神经功能缺损的影响Sham(假手术组)大鼠行为、肢体功能无异常表现,评分:0分。而模型组出现向对侧转圈或者倾倒等神经功能缺失,和假手术组比较模型组神经功能缺损评分具有显著性差异。各治疗组在缺血再灌注6h、24h、72h时神经功能缺损评分无显著性差异(P>0.05),在I/R后72h时,神火灸治疗组和艾灸治疗组与模型组相比,神经功能缺损并未出现显著改善(P>0.05),而在治疗7d时,神火灸治疗组神经功能缺损较模型组有降低(P<0.05),效果持续至14天更明显(P<0.01)。艾灸组与模型组比较对神经功能缺损的影响并不明显(P>0.05)。而NAC组作为一种抗氧化剂,在使用7d、14d明显起效,显著改善I/R大鼠神经功能缺陷,与模型组比较具有显著性差异(P<0.01),与神火灸组疗效相当(P>0.05);和模型组比较,NAC+神火灸在7d、14d出现神经功能缺损评分降低(P<0.01)。14d时,神火灸+NAC联用神经功能缺损评分数值下降,但和单用神火灸比较差异并不显著。2、瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠脑损伤体积的影响通过图像分析软件分析及计算,与假手术组比较,TTC染色后MCAO术后大鼠冠状脑组织切片可见明显脑梗塞病灶(P<0.01),在治疗开始的24h时,梗塞体积未见明显差异,说明各治疗组在24h内均未对I/R大鼠脑梗死体积产生影响;14d时,艾灸组脑梗死体积与模型组比较具有统计学差异(P<0.05);神火灸组、NAC组和NAC+神火灸治疗组与模型组比较,大鼠梗死体积下降明显,统计具有显著差异(P<0.01),说明神火灸对脑梗死体积的神经保护作用较明显,NAC也具有神经保护的作用,其保护作用神火灸和NAC 比较对脑梗塞体积的影响未见明显差异,神火灸和NAC联用梗死体积数值下降,但和单用神火灸比较差异并不显著(P>0.05)。3、神火灸对动物大鼠的缺血再灌注损伤缺血脑组织相关病理学影响HE染色结果提示,假手术组(sham)大鼠脑组织细胞形态学基本正常,而模型组大鼠出现缺血中心神经细胞坏死,组织结构排列紊乱,细胞间隙增宽,细胞肿胀,核固缩,结构严重破坏;而神火灸治疗可改善神经元细胞死亡率,减轻缺血再灌注损伤,相对于模型组,其神经细胞异常相对较轻,核膜完整、染色质均匀一致、细胞器破坏较少;艾灸组其形态学改变和神火灸组基本一致;而NAC和NAC+神火灸治疗组大鼠缺血脑组织于镜下可见神经肿胀较轻,较模型组坏死细胞的数量显著减少,说明NAC作为抗氧化剂保护作用明确,和神火灸联用时炎症细胞浸润减少,细胞坏死、核固缩情况明显减轻。4、Nissl染色法观察缺血脑组织神经元数目Nissl染色结果显示,与模型组相比,神火灸和艾灸治疗组Nissl小体的数量增多,细胞形态较为正常,结构较为完整,提示灸治疗可减少I/R后神经元的损伤;而NAC组和NAC+神火灸治疗组Nissl小体的数量更多,大部分细胞形态正常,结构完整,说明NAC和NAC+神火灸治疗明显促进了脑缺血组织神经元存活。5、瑶医神火灸对缺血再灌注大鼠MDA、SOD表达情况的影响本实验显示,脑缺血再灌注造模后,与假手术组比,模型组MDA水平明显上升(P<0.01),SOD活化明显降低(P<0.01),表明氧化应激损伤明显,SOD活性受到明显抑制,抗氧化能力减低。使用艾灸干预时,MDA水平下降,与模型组相比具有统计学差异(P<0.05),SOD活性上升(P<0.05);神火灸干预后,MDA水平明显下降(P<0.01),SOD活性明显上升(P<0.01),说明神火灸治疗能够显著提高SOD的活化能力,增强I/R损伤大鼠脑组织抗氧化应激的能力,减轻氧化应激相关损伤,并通过抗脂质过氧化相关反应对I/R损伤起保护作用。而在给予NAC侧脑室注射及NAC联合神火灸治疗时,缺血再灌注大鼠脑组织的SOD活力明显升高(P<0.01),MDA含量明显降低(P<0.01),其抗氧化效果优于单用神火灸(P<0.05),提示NAC可调节缺血再灌注损伤引起的机体氧自由基释放、氧化还原应激失衡状态,减轻机体的氧化应激损伤,在与瑶医神火灸联合使用时,对SOD活性的激活和降低MDA含量方面明显优于单独使用神火灸(P<0.01)。6、瑶医神火灸对炎症因子表达情况的影响(TNF-α、IL-1、IL-10)研究结果显示,14d时,与Sham组比较,模型组TNF-α、IL-1 β、IL-10水平显著上升(P<0.01);与模型组比较,神火灸组和艾灸治疗组干预后TNF-α、IL-10、IL-1 β水平下降具有显著性差异(P<0.01);NAC组和NAC+神火灸治疗组TNF-α、IL-1 β、IL-10水平与神火灸治疗组具有相同变化趋势,与模型组比较水平下降明显(P<0.01)。而与神火灸组比较,NAC+神火灸联用TNF-α、IL-1 β水平明显下降(P<0.01),IL-10也有所下降(P<0.05),说明NAC和神火灸联用对炎症因子的降低作用更明显。7、瑶医神火灸对细胞凋亡的影响本实验显示,脑缺血再灌注造模后,与假手术组相比,模型组Tunel阳性细胞明显增加,表明细胞凋亡显著增加。使用艾灸和神火灸干预后,Tunel阳性细胞明显减少,与模型组相比,具有明显统计学差异(P<0.01),说明神火灸治疗能够一定程度上减少缺血脑组织细胞的凋亡,对I/R损伤起保护作用。而在给予NAC侧脑室注射及NAC联合神火灸治疗时,缺血再灌注大鼠脑组织的细胞凋亡较模型组明显降低(P<0.01),提示NAC可明显减轻缺血脑组织细胞凋亡。与神火灸组比较,NAC及NAC联合神火灸使用对细胞凋亡率的影响差异不显著(P>0.05)。8、瑶医神火灸对NF-κ B通路相关蛋白及下游凋亡因子的影响(Cox-2、iNOS、NF-κ B/p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3)8.1脑组织中Cox-2、iNOS表达情况(免疫组化、WB检测、qPCR检测)研究结果提示,在缺血再灌注损伤后,和Sham组相比,免疫组化法显示模型组大鼠脑组织中Cox-2、iNOS阳性表达细胞增加(P<0.01),脑组织中Cox-2和iNOS蛋白含量增加(P<0.01),Cox-2 mRNA 和 iNOS mRNA 含量升高(P<0.01),提示 Cox-2、iNOS参与了缺血再灌注损伤的过程;与模型组相比,艾灸组Cox-2免疫组化阳性细胞表达、Cox-2蛋白表达显著减少(P<0.01),Cox-2mRNA含量减少(P<0.05),iNOS 阳性细胞表达减少(P<0.05),iNOS蛋白表达、iNOSmRNA含量显著减少(P<0.01)。与模型组比较,神火灸治疗可以明显降低Cox-2、iNOS阳性细胞表达,降低脑内Cox-2、iNOS蛋白的表达和脑内Cox-2、iNOSmRNA含量,结果具有显著统计学差异(P<0.01),提示神火灸和艾灸一样,具有抑制Cox-2和iNOS保护脑组织的作用,并且与神火灸组相比,艾灸对iNOS 阳性细胞的表达明显升高(P<0.01),iNOS蛋白表达增加(P<0.05),提示神火灸抑制iNOS表达的作用优于艾灸组。而对于NAC组和NAC+瑶医神火灸治疗组,Cox-2、iNOS 阳性表达细胞减少,脑组织中Cox-2和iNOS蛋白含量减少,Cox-2 mRNA和iNOS mRNA含量减少较模型组更明显(P<0.01),说明NF-κ B的抑制剂NAC可以明显减少Cox-2、iNOS的阳性表达,逆转脑组织缺血后的损伤,促进神经功能修复。与神火灸组比较,NAC+神火灸联用对Cox-2阳性细胞的表达、Cox-2、iNOS蛋白含量和Cox-2、iNOS mRNA的表达水平下降更为明显(P<0.01),提示联合应用对Cox-2、iNOS的影响明显优于单独使用神火灸。8.2脑组织中NF-κ B/p65表达情况(免疫组化、WB检测、qPCR检测)本研究结果提示,在脑缺血再灌注14d后,免疫组化结果显示,与Sham组比较,模型组缺血脑组织NF-κ B p65阳性表达增多(P<0.01),说明NF-κ B p65被激活,同时NF-κ B p65移位到胞核内的阳性细胞数增多,同时WB提示NF-κ B p65蛋白的表达增加(P<0.01),qPCR 提示 NF-κ B p65 mRNA 上调(P<0.01),说明 NF-κ B p65通路被激活。与模型组比较可以看出,艾灸治疗可以减少缺血脑组织NF-κ B/p65阳性细胞表达(P<0.05)、降低脑内NF-κ B/p65蛋白表达(P<0.05),显著减少脑内NF-κB/p65mRNA表达(P<0.01),而神火灸减少NF-κ B/p65阳性细胞表达、蛋白表达及脑内NF-κ B/p65mRNA表达更明显(P<0.01),提示神火灸和艾灸治疗可能是通过抑制缺血脑组织NF-κ B/p65表达起到减轻MACO大鼠I/R脑损伤作用。而在降低脑内NF-κ B/p65蛋白表达方面,神火灸组优于艾灸组(P<0.05)。而NAC和NAC+神火灸可以显著减少NF-κ B/p65阳性细胞表达、蛋白表达及脑内NF-κ B/p65mRNA表达(P<0.01),效果显著,并且NAC和神火灸联用对NF-κ B/p65的作用显著优于单一的神火灸治疗(P<0.01)。8.3脑组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3表达情况(免疫组化、WB检测、qPCR检测)本实验通过对I/R大鼠的免疫组化、Western blot及qPCR检测发现,与Sham组相比MCAO组Bax、caspase-3明显升高(P<0.01),Bcl-2水平明显降低(P<0.01)。与模型组比较,艾灸治疗组Bax阳性细胞表达明显减少(PP<0.01),Bcl-2阳性细胞增加、caspase-3 阳性细胞表达减少无统计学意义(P>0.05),脑内Bax、caspase-3蛋白表达下降(P<0.01),脑内Bax mRNA表达减少(P<0.05)、Caspase-3 mRNA表达显著减低(P<0.01);脑内Bcl-2蛋白增加无显著意义(P>0.05),Bcl-2 mRNA水平增加(P<0.05);说明艾灸对于Bax、caspase-3、Bcl-2的调节具有一定作用,但是作用不稳定,各种检测结果存在差异。而与模型组相比,神火灸组Bax、caspase-3阳性细胞表达减少(P<0.01),Bcl-2阳性细胞表达升高(P<0.05);Bax、caspase-3蛋白表达下降(P<0.01),Bcl-2 蛋白表达上升(P<0.01),脑内 Bax mRNA、caspase-3 mRNA表达下降明显(P<0.01),及脑内Bcl-2mRNA表达上升(P<0.01),说明神火灸治疗可以通过影响细胞内Bcl-2、Bax、caspase-3等相关凋亡因子的水平从而影响细胞凋亡,并且和艾灸组比较,神火灸对降低Bax、Caspase-3蛋白表达的作用优于艾灸(P<0.01)。对于NAC组及神火灸+NAC组,caspase-3、Bax阳性细胞表达、脑内蛋白水平和mRNA水平下降更为明显(P<0.01),Bcl-2阳性细胞表达、脑内蛋白水平和mRNA水平明显上升(P<0.01),提示NAC具有影响相关凋亡因子抗凋亡的作用,联合神火灸使用对于细胞凋亡途径的影响作用更强,和神火灸单一治疗比较差异具有显著统计学意义(P<0.01),联合治疗可以起到较强抗凋亡的神经保护作用。结论:1.神火灸改善了脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损情况,减轻了缺血脑组织形态和病理学改变,对缺血再灌注大鼠具有神经保护的作用。2.瑶医神火灸对脑缺血再灌注大鼠损伤的神经保护作用与抗炎、抗氧化、抗凋亡的机制可能相关;3.瑶医神火灸对神经保护的作用机制可能是通过抑制NF-κ B炎症通路发挥抗炎、抗凋亡的作用。