论文部分内容阅读
目的:拓扑替康（TPT）通过与拓扑异构酶-Ⅰ结合并抑制其功能，导致DNA双链断裂进而诱导肿瘤细胞凋亡。目前拓扑替康作为一个有效的化疗药物和放疗增敏剂用于肺癌、头颈部鳞状细胞癌以及卵巢癌的治疗。虽不少临床研究报道拓扑替康用于宫颈癌化疗效果不错，但用于晚期宫颈癌同步放化疗的研究较少。本研究拟设计体外实验，研究拓扑替康对宫颈癌细胞HeLa的杀伤作用，分析拓扑替康作为放射增敏剂在杀伤肿瘤细胞中发挥的作用；同时与顺铂和泰素的放射增敏作用进行比较
方法:
1.培养人子宫颈癌HeLa细胞，将处于对数生长期的细胞用于实验；
2.不同浓度的拓扑替康、顺铂和泰素作用于宫颈癌HeLa细胞，不同时间后(24小时，48小时和72小时)，应用噻唑蓝法（MTT法）检测不同时间组、浓度组吸光光度值，研究三种化疗药物对宫颈癌HeLa细胞增殖能力的影响，分析抑制作用与时间、剂量的关系；
3.计算三种药物24小时 50％抑制浓度（IC50）用于后续实验；
4.将HeLa细胞分为 a.空白对照组、b.单放射组、c.单化疗组和d.放射增敏组，对应给予相关处理后，采用Annexin V/碘化丙啶双染色法，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，分析拓扑替康、顺铂和泰素的放射增敏作用；
5.将HeLa细胞分为空白对照组、单放射组、单化疗组和放射增敏组，单化疗组和放射增敏组予拓扑替康、顺铂和泰素作用24小时和48小时后，将单放射组和放射增敏组予以放射线辐射，应用细胞克隆形成法检测HeLa细胞增殖能力情况，从而分析各化疗药物联合放射线辐射对肿瘤细胞的杀伤作用；
6.应用单击多靶模型拟合细胞存活曲线，计算各种参数以分析各化疗药物联合放射线辐射对肿瘤细胞的抑制作用，并计算拓扑替康、顺铂和泰素24小时和48小时时放射增敏比。
结果:
1.拓扑替康、顺铂和泰素对HeLa细胞增殖的抑制程度，随作用时间延长和药物浓度增加，呈时间和浓度依赖性。拓扑替康不同作用时间（24小时、48小时、72小时）的IC50分别为8.0 μg/ml，2.6 μg/ml和0.8 μg/ml；顺铂的IC50分别为2.37 μg/ml，0.67 μg/ml和0.11 μg/ml；泰素的IC50分别为0.26 μg/ml，0.09 μg/ml和0.02μg/ml。
2.泰素24小时 IC50仅为泰素血峰值浓度（PPC）的2.0％（0.26:13.6）；而顺铂24小时 IC50为其PPC的62.4％（2.37:3.8），拓扑替康24小时 IC50为其PPC 10.7倍的(8:0.75)。
3.流式细胞仪检测对照组中凋亡细胞比例为4.63％，单放射组细胞凋亡率为14.4％，拓扑替康单化疗组细胞凋亡率为45.7％，放射增敏组为70.2％；顺铂单化疗组细胞凋亡率为43.9％，放射增敏组为78.9％；泰素单化疗组细胞凋亡率为51.7％，放射增敏组为65.3％。卡方检验示三种化疗药物的放射增敏组肿瘤细胞凋亡率均明显高于单放射组和单化疗组。
4.细胞克隆形成法表明三种化疗药物作用24小时和48小时后联合放射线辐射，对HeLa细胞的杀伤作用明显增强，提示拓扑替康、顺铂和泰素具有放射增敏作用，且化疗药物作用时间越长增敏效果越明显。
5. 应用SigmaPlot软件按单击多靶模型 SF=1－(1－e-D/Do)N拟合细胞存活曲线，计算放射辐射参数及放射增敏比。拓扑替康放射增敏24小时组和放射增敏48小时组放射增敏比分别为1.167和1.344；顺铂放射增敏组的放射增敏比分别为1.314和1.538；泰素放射增敏组的放射增敏比分别为1.076和1.316；顺铂放射增敏比最高，泰素最低。
结论:拓扑替康、顺铂和泰素对宫颈癌HeLa细胞抑制作用十分明显，都呈时间依赖性和浓度依赖性。对比三种药物血峰值浓度：拓扑替康24小时 IC50与其PPC的比值最大（10.7），泰素24小时 IC50与其PPC的比值最小（2.0％）。这提示泰素体外对宫颈癌HeLa细胞的抗肿瘤作用最强，顺铂次之，而拓扑替康体外抗HeLa细胞作用比较温和。进一步放射增敏实验中，放射增敏组放射增敏比均大于1，提示放射增敏作用。横向来看，24小时顺铂放射增敏比最高（1.314），拓扑替康次之（1.167）泰素最小（1.076）；48小时各放射增敏比大小顺序如前。可见体外对宫颈癌HeLa细胞，顺铂的放射增敏作用最强，泰素较弱。而拓扑替康虽然对HeLa细胞直接杀伤作用不如顺铂和泰素，但其放射增敏作用大于泰素，次于顺铂。