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一直以来,中药材的质量问题都是科研研究的热点问题,而常用的中药材丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)质量问题的核心内容是丹参的道地性问题,要从根本上解决丹参的质量问题,解析丹参道地性遗传特征是关键。丹参酮是丹参的主要有效成分,本研究发现丹参酮代谢途径上游的4-(5’-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(SmCMK)关键功能基因具有“产地趋向变异(GVT)”的特征,并以功能基因SmCMK作为模板,克隆不同产地SmCMK基因,分析其变异类型,采用原核表达的研究方法诱导蛋白,并进行体外酶促反应,催化产物用LC-MS技术进行分析,通过产物峰强度比较酶的催化效能,从而解析丹参功能基因的GVT规律对关键酶生物合成功能的影响,从而探究丹参道地性的遗传特征。具体研究成果如下:1.成功克隆SmCMK基因全长并发现产地趋向变异现象SmCMK基因全长为1191 bp,编码397个氨基酸残基,理论分子量(Molecular weight,MW)为43.35kDa,等电点(PI)为6.72,并有45个非极性氨基酸残基(Asp+Glu)和44 个极性氨基酸残基(Arg+Lys),疏水性平均值(Grand average of hydropathicity,GRAVY)为-0.289,不稳定系数(Instability index,II)为36.89,说明SmCMK蛋白是有一定亲水性的,且结构稳定。N端1-53位氨基酸残基可能为信号肽,主要定位于叶绿体,与十字花科鼠耳芥Arabidopsis CMK的亲缘关系最近。同时,发现SmCMK基因中存在可分析的产地趋向变异位点有6个,分别位于102bp,105bp,115bp,120bp,909bp 和 1110bp 处。其中,在 102bp,105bp 和 115bp 处,内蒙居群分别产生了明显的:“G”型“C”型和“C”型的产地趋向变异类型,且都为产地特化变异类型。在909bp和1110bp处,山西和山东居群分别产生了“T”型和“C”型的产地特化变异类型。120bp处,河北和山西居群都出现了“C”型的产地趋向变异类型。氨基酸序列中,河北居群和山西居群发生非同义突变,即亮氨酸“L”突变为苯丙氨酸“F”。另外内蒙和山东各有一处产地特化非同义突变,分别突变为脯氨酸“P”和天冬氨酸“D”。2.成功构建原核表达体系成功建立SmCMK原核表达体系,确定可溶最佳诱导条件为:诱导温度15℃、转速80rpm、诱导时间12h、IPTG为0.25 mmol·L-1、A600为0.8,经过PCR和测序验证,证明原核表达体系构建成功;经过聚丙烯酰胺凝胶电泳验证,证明蛋白诱导成功。3.成功进行了 SmCMK的功能验证并分析了不同产地基因型对催化效能的影响证明丹参SmCMK基因具有催化1分子ATP和1分子4-二磷酸胞苷-2-C甲基赤藓醇(CDP-ME)生成1分子ADP和1分子4-二磷酸胞苷-2-C甲基-D赤藓醇-2-磷酸(CDP-MEP)的功能。丹参催化效能比较显示,四川产地的CMK基因的催化效能最高,其次分别为山东、山西、湖北、河北、河南、内蒙。道地产区SmCMK基因催化效能都普遍高于非道地产区。结果印证了丹参的道地性,也证明了“产地趋向变异”可以影响催化效能。综上所述,本研究发现SmCMK具有产地趋向变异现象,它的催化效能分析也进一步印证了丹参的道地性。因此,本研究能够为进一步揭示丹参道地性的遗传机制奠定良好支持。