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研究目的
血管平滑肌细胞衰老(senescence)在多种血管疾病的发病机制中可能占有重要位置。动脉瘤(Aneurysm)是由血管壁退行性变引起的血管管腔病理性扩张。临床上常见的动脉瘤是腹主动脉瘤(Abdominal Aortic Aneurysm，AAA)。AAA破裂及其相关并发症引起的总死亡率超过80％。最新研究发现，血管平滑肌细胞衰老与AAA的发生发展亦密切相关。细胞衰老是多种应激条件下慢性损伤的结果，例如氧化应激、基因毒性应激和复制应激等。核仁是发生核糖体DNA(ribosomal DNA，rDNA)转录和核糖体生物合成的场所。抑制真核细胞中RNA聚合酶Ⅰ(RNApolymeraseⅠ，PolⅠ)介导的rDNA转录可触发一种独特的细胞应激反应，称为核仁应激(也称为核糖体应激)。我们课题组前期研究发现在血管平滑肌细胞中抑制rDNA转录、诱导核仁应激能够引起G2/M细胞周期阻滞，并且某些细胞衰老的标志物表达上调。
本课题中我们对这一现象进行更深入的研究。我们提出以下科学假说:干扰rDNA转录过程诱导细胞核仁应激能够诱发血管平滑肌细胞出现衰老的表型，并且能够加速动脉管壁出现动脉瘤样的退行性病理改变。为了验证这一假说，我们主要关注了以下三个方面的科学问题:(1)人AAA组织和小鼠AAA模型中PolⅠ转录复合体关键组分的表达是否发生变化;(2)用平滑肌特异性敲除TIF-IA(PolⅠ转录复合体关键组分之一)的小鼠及特异性PolⅠ抑制剂(CX-5461)为手段，研究干扰rDNA转录、诱导细胞核仁应激是否能加速血管壁动脉瘤样退行性病变的发生发展;(3)在细胞水平阐明干扰rDNA转录诱发核仁应激反应是否加速血管平滑肌细胞出现衰老表型，探索可能的机制，并进一步验证在AAA组织中是否存在以上这些细胞学改变。
研究方法
一、动脉瘤组织中PolⅠ转录复合体关键组分的表达变化及干扰rDNA转录对血管壁动脉瘤样退行性病变发生发展的影响
1.动物模型及分组
选用8周龄ApoE-/-雄性小鼠建立AngⅡ诱导的AAA模型;选用8周龄C57BL/6雄性小鼠建立CaCl2/PBS(Ca/P)诱导的AAA模型。ApoE-/-小鼠被随机分为2组，假手术组和AngⅡ模型组，每组12只。在第7天及第28天取材。将C57BL/6小鼠随机分为2组，PBS对照组和Ca/P模型组，每组12只。在第7天及第28天取材。在药物干预实验中，C57BL/6小鼠被随机分为3组，每组10只，分别为PBS组、Ca/P组和Ca/P+CX-5461处理组(CX+Ca/P)。
2.AngⅡ诱导的AAA模型
将AngⅡ按照1000ng/min/kg的剂量灌入渗透泵中，假手术(Sham)组灌入等量生理盐水。ApoE-/-小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠(40mg/kg)溶液进行麻醉后，小鼠取俯卧位，颈后部备皮后取一长约1cm的横切口，用眼科剪钝性分离背部皮肤与皮下组织，按照分组将渗透泵埋于皮下，将渗透泵置于皮下，逐层缝合切口。待小鼠苏醒后放回鼠笼，给予普通饮食。分别于造模第7天、第28天取材。用qPCR检测血管组织中UBF、TIF-IA、TBP、RPA43(PolⅠ与TIF-IA连接的亚基)mRNA的表达变化。
3.Ca/P诱导的AAA模型
C57BL/6小鼠用小动物麻醉机吸入异氟烷气体进行麻醉，备皮后取下腹部正中切口，找到腹主动脉，仔细分离周围结缔组织，暴露出肾下腹主动脉段(近心端至肾动脉分叉处，远心端至髂动脉分叉处)。将充分浸润CaCl2溶液(0.5M)的棉条覆盖在腹主动脉表面，敷育10分钟。然后换成浸润无菌磷酸盐缓冲液(PBS)的棉条继续敷育5分钟。敷育完毕后用生理盐水冲洗腹腔，用无菌棉球将冲洗液吸干。PBS对照组只敷育浸润PBS的棉条15分钟。逐层缝合组织，待小鼠苏醒后放回鼠笼，术后给予美洛昔康(1 mg/kg)镇痛处理。分别于造模第7天、第28天取材。用qPCR检测血管组织中UBF、TIF-IA、TBP、RPA43mRNA的表达变化。
药物干预实验:CX+Ca/P组在敷育棉条的部位滴加50μL含CX-5461(终浓度10μM)的PluronicF127凝胶。PBS组和Ca/P组滴加等量不含药物的PluronicF127凝胶。待F127凝胶凝固后将肠管复位。术后4周取材，观察腹主动脉血管有无明显膨出并测量其最大直径，对组织切片进行弹性纤维染色(Verhoeffsvangieson染色，简称EVG染色)和苏木素-伊红(HE)染色，对血管弹力层的破坏进行评分并作比较。
4.smTIF-IA-/-小鼠的繁育及表型检测
将雌性TIF-IAflox/flox小鼠和雄性平滑肌细胞骨架蛋白(SMA)启动子驱动的Cre表达小鼠(SMA-Cre)交配繁殖，得到TIF-IA+/-Cre小鼠，再将雌雄TIF-IA+/-Cre小鼠交配繁殖得到平滑肌特异性敲除TIF-IA基因(smTIF-IA-/-)小鼠。取同窝出生的TIF-IA+/+小鼠作为野生型对照。观察小鼠状态、体重，检测并记录小鼠血压。取不同周龄小鼠进行解剖取材，将小鼠主动脉血管进行HE染色及EVG染色并统计血管中膜的平均厚度、观察弹力层形态改变、免疫组化检测平滑肌α肌动蛋白(α-SMA)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、以及巨噬细胞标记物F4/80的表达。
5.人腹主动脉瘤组织标本收集及处理
收集2016年10月至2018年9月于山东大学齐鲁医院行腹主动脉瘤切除加人工血管置换术的患者组织标本。收集2016年11月至2018年3月于山东大学齐鲁医院器官移植中心进行肾脏移植术时部分残留的正常腹主动脉组织作为正常对照。用qPCR检测组织中UBF、TBP、TIF-IAmRNA的表达及pre-rRNA/18SrRNA的比值。Westernblot检测组织中TBP、TIF-IA的蛋白表达。
二、干扰rDNA转录对血管平滑肌细胞衰老的影响及其与动脉瘤病变的关系
1.PolⅠ抑制剂对血管平滑肌细胞衰老表型的影响
分别用两种PolⅠ抑制剂CX-5461和BMH-21处理小鼠平滑肌细胞系(MOVAS)和人主动脉平滑肌细胞(HASMC)。用SA-β-Gal(衰老相关β半乳糖苷酶)染色实验检测衰老细胞的比例，用qPCR检测衰老相关标志物p21Cip1、p16INK4a和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的表达，以及衰老相关分泌因子白介素(IL)-6和IL-8的表达。
2.TIF-IA基因沉默对血管平滑肌细胞衰老表型的影响
用表达shRNA的慢病毒载体敲低MOVAS细胞中TIF-IA基因的表达，用qPCR和Westernblot检测慢病毒干扰效率。用qPCR检测敲低TIF-IA基因对rDNA转录复合体关键因子UBF、polr-1A(编码PolⅠ最大的亚基)和RPA43表达的影响;检测其对p21Cip1、PAI-1、IL-6及IL-8表达的影响。用CellCountingKit-8(CCK-8)和流式细胞术分别检测TIF-IA基因沉默对细胞增殖和细胞周期的影响。
3.TIF-IA基因沉默对平滑肌细胞DNA损伤反应的影响
敲低TIF-IA基因后，用细胞免疫荧光检测MOVAS细胞中核仁磷蛋白(nucleophosmin，NPM)在细胞核中的分布，用Westernblot和/或免疫荧光检测p53蛋白及其磷酸化水平以及ATM、ATR的磷酸化水平。用细胞免疫荧光检测敲低TIF-IA对MOVAS细胞核中磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)和DNA依赖蛋白酶的催化亚单位(DNA-PKCs)水平的影响。用碱性彗星电泳实验检测敲低TIF-1A基因对DNA链断裂的影响。
4.AAA组织中核仁应激、细胞衰老及DNA损伤反应的变化
用qPCR检测人AAA组织中p21Cip1、PAI-1、MMP-2和MMP-9的表达。用免疫组化/免疫荧光检测人AAA中膜组织中DNA损伤通路相关的p53、ATR及ATM/ATR底物S/T*Q的磷酸化水平，检测γH2AX的表达变化并用免疫荧光双标法将γH2AX与α-SMA共定位。为了明确AAA中DNA损伤是否与核仁应激增加有关，对NPM进行了免疫荧光染色，并将NPM和γH2AX进行共定位，对共定位情况进行分析。
在smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜组织中，用免疫组化检测p53及ATR磷酸化水平。用SA-β-Gal染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)实验检测smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜细胞的衰老和凋亡情况。用免疫组化检测组织中PAI-1及IL-8的表达变化。
结果
一、动脉瘤组织中PolⅠ转录复合体关键组分的表达变化及干扰rDNA转录对血管壁动脉瘤样退行性病变发生发展的影响
1.人腹主动脉瘤组织中PolⅠ转录复合体关键组分的表达变化
qPCR检测结果显示，与正常主动脉组织相比，人AAA组织中TIF-IAmRNA表达水平下调，而TBPmRNA表达上调，UBF的表达没有显著改变。Westernblot检测结果显示TIF-IA蛋白表达降低，TBP蛋白表达升高。qPCR检测结果显示45Spre-rRNA与成熟18SrRNA的比率下降。
2.AngⅡ诱导的AAA组织中PolⅠ转录复合体关键组分的表达变化
多普勒超声检测显示，AngⅡ诱导的AAA模型中第7天腹主动脉最大直径增大50％，第28天最大直径增大140％。qPCR结果显示，第7天时UBF、TBP和RPA43的表达水平没有显著改变，而TIF-IA的水平降低。第28天时UBF、TIF-IA的表达水平均降低，而TBP和RPA43表达没有明显变化。
3.Ca/P诱导的AAA组织中PolⅠ转录复合体关键组分的表达变化
HE染色结果显示，Ca/P诱导的AAA模型于第7天开始出现中膜弹性纤维破坏和炎症细胞浸润;第28天中膜弹性纤维破坏加重、出现明显弹力层断裂及炎症细胞浸润。qPCR结果显示，UBF的表达在第7天没有变化，但在第28天显著下降。TIF-IA的表达在第7天和第28天均显著下调。TBP的表达在第7天上调，而在第28天没有明显变化。相比之下，RPA43在两个时间点的表达均无明显变化。
4.smTIF-IA-/-小鼠主动脉璧自发出现动脉瘤样退行性病变
smTIF-IA-/-小鼠在出生时可以存活，但表现出生长迟缓，体重比野生型小鼠约轻10-20％。在4～10周龄时发生自发性死亡，死亡发生前无明显的行为异常。对死亡小鼠进行尸检，未发现腹腔或胸腔出血。组织病理学检查显示，100％的smTIF-IA-/-小鼠在胸、腹主动脉均有广泛的动脉瘤样退行性病变。
组织病理学检查显示血管病变表现为弹力层的紊乱和断裂，平滑肌细胞减少，主动脉血管壁平均厚度降低。免疫组化结果显示，smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜MMP-2和MMP-9表达水平升高。此外，smTIF-IA-/-小鼠主动脉血管周围区域巨噬细胞浸润增加。
5.特异性PolⅠ抑制剂CX-5461加重Ca/P诱导的AAA形成
为了进一步阐明干扰rDNA转录是否在动脉瘤形成中起致病作用，我们在Ca/P模型中腹主动脉周围局部应用CX-5461干预。结果显示，CX-5461增加了Ca/P诱导的AAA发生率。经CX-5461处理的腹主动脉的平均直径明显大于对单纯造模组。组织病理学分析显示，CX-5461处理的腹主动脉中膜弹力层断裂和丢失更为明显。对小鼠血管中膜弹性纤维组织分级统计发现，CX+Ca/P组腹主动脉中膜弹性纤维分级高于CaP组(评分越高组织破坏越显著)。
二、干扰rDNA转录对血管平滑肌细胞衰老的影响及其与动脉瘤病变的关系
1.抑制rDNA转录诱导平滑肌细胞出现衰老样表型
SA-β-Gal染色显示CX-5461(0.5μM)处理MOVAS细胞后衰老细胞比例升高。qPCR结果显示，CX-5461和另外一个PolⅠ抑制剂BMH-21(0.5μM)处理后细胞衰老相关基因p21Cip1、p16INK4a和PAI-1的表达水平与对照组相比均显著升高，同时衰老相关分泌因子IL-6和IL-8的mRNA表达水平也高于对照组。用BMH-21(5μM)处理HASMC细胞同样增加SA-β-Gal阳性衰老细胞的比例。qPCR结果显示，CX-5461(0.5μM)和BMH-21处理HASMC后p21Cip1、p16INK4a和PAI-1的表达水平均显著上调。Westernblot结果显示，BMH-21处理的HASMC中p21Cip1蛋白表达增加。
2.TIF-IA基因沉默诱导MOVAS细胞出现类似衰老的表型
MOVAS细胞中沉默TIF-IA基因表达48小时后，qPCR和Wsternblot检测均显示TIF-IA基因敲低效率大于90％，而PolⅠ复合体其它组分UBF、Polr-1A和RPA43的水平均无明显变化。CCK-8实验结果显示TIF-IA基因敲低后细胞增殖速率减慢。流式细胞术检测结果显示TIF-IA基因敲低诱导细胞出现G2/M期阻滞和S期时相延长。TIF-IA基因敲低组细胞中p21Cip1、PAI-1、IL-6和IL-8的表达水平显著高于对照组。
3.干扰rDNA转录引起平滑肌细胞核仁应激及p53通路激活
细胞免疫荧光结果显示，敲低TIF-IA基因使MOVAS细胞核仁蛋白NPM在核仁/核质中的比例下降，提示NPM出现核仁向核质的弥散。核仁形态改变，出现了核仁帽结构，提示细胞出现核仁应激反应。Westernblot和细胞免疫荧光检测发现TIF-IA基因沉默显著增加了p53(Ser15位)的磷酸化水平，而总的p53蛋白水平没有明显变化。
4.干扰rDNA转录引起的p53磷酸化可能与激活非典型的DNA损伤反应有关
细胞免疫荧光检测结果显示MOVAS细胞中敲低TIF-IA显著增加ATM/ATR的磷酸化水平，同时增加γH2AX和DNA-PKCs阳性细胞的比例。然而用碱性彗星电泳实验检测发现干扰rDNA转录并没有引起广泛的DNA链断裂，提示干扰rDNA转录在血管平滑肌细胞中引起的p53磷酸化可能与激活一种非典型性的DNA损伤反应有关。
5.细胞核仁应激、DNA损伤反应、衰老与动脉瘤病变的关系
qPCR结果显示人AAA组织中PAI-1、p21Cip1、MMP-2和MMP-9的表达均上调，表明细胞衰老水平增加。根据α-SMA免疫组化结果选取中膜富含平滑肌细胞的区域进行观察，NPM免疫荧光染色显示AAA组织中核仁形态异常(表现为NPM荧光信号弥散)的细胞数量增加。免疫组化结果显示p53磷酸化(Ser15)水平在AAA组织中显著升高。在AAA组织中，细胞核中γH2AX染色阳性细胞的比例显著增加。免疫荧光结果显示phospho-ATR阳性细胞比例比对照血管组升高。此外，ATM/ATR底物功能域S/T*Q的磷酸化水平在AAA组织中也呈增加趋势。深入分析γH2AX和NPM免疫荧光双标结果发现，一半以上的γH2AX阳性细胞中γH2AX与弥散的NPM呈现共定位。没有γH2AX-NPM共定位的γH2AX阳性细胞中，大部分核仁结构完好(没有核仁应激现象))。这些结果提示在AAA组织中细胞p53磷酸化水平增加伴随核仁应激增加和DNA损伤反应增加，而且DNA损伤反应的发生部分定位于核仁内，提示可能与rDNA有关。
为进一步验证以上结果，我们在smTIF-IA-/-小鼠主动脉中进行观察，SA-β-Gal染色显示smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜中衰老细胞数量增多。免疫组化结果显示smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜细胞p-p53和p-ATR阳性细胞比例增高，同时IL-8和PAI-1表达增多。相反，TUNEL染色结果显示与野生型小鼠相比，smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜中细胞凋亡没有发生明显改变。
结论
动脉瘤组织中PolⅠ转录复合体关键组分的表达水平出现差异性改变。整体情况下干扰平滑肌细胞rDNA转录过程加速血管壁动脉瘤样退行性病变的发生发展。在体外，干扰平滑肌细胞rDNA转录过程，诱导细胞核仁应激，可能通过触发非典型性DNA损伤反应激活p53通路，进一步导致平滑肌细胞出现衰老样表型。在人AAA组织中膜中细胞p53磷酸化水平增加，并伴随核仁应激增加和DNA损伤反应增加，而且DNA损伤反应的发生部分定位于核仁内，提示可能与rDNA有关。
创新性及意义
1.首次揭示了rDNA转录障碍可能参与动脉瘤的发生发展。
2.构建的平滑肌细胞特异性TIF-IA基因敲除小鼠可能作为研究动脉瘤样病变发生的新型动物模型。
局限性
1.在体内实验中尚未完成针对细胞衰老进行的干预实验。
2.在体外实验中没有观察抑制DNA损伤反应对平滑肌细胞衰老的影响，不能确立诱发的非典型性DNA损伤反应与细胞衰老之间的因果联系。
血管平滑肌细胞衰老(senescence)在多种血管疾病的发病机制中可能占有重要位置。动脉瘤(Aneurysm)是由血管壁退行性变引起的血管管腔病理性扩张。临床上常见的动脉瘤是腹主动脉瘤(Abdominal Aortic Aneurysm，AAA)。AAA破裂及其相关并发症引起的总死亡率超过80％。最新研究发现，血管平滑肌细胞衰老与AAA的发生发展亦密切相关。细胞衰老是多种应激条件下慢性损伤的结果，例如氧化应激、基因毒性应激和复制应激等。核仁是发生核糖体DNA(ribosomal DNA，rDNA)转录和核糖体生物合成的场所。抑制真核细胞中RNA聚合酶Ⅰ(RNApolymeraseⅠ，PolⅠ)介导的rDNA转录可触发一种独特的细胞应激反应，称为核仁应激(也称为核糖体应激)。我们课题组前期研究发现在血管平滑肌细胞中抑制rDNA转录、诱导核仁应激能够引起G2/M细胞周期阻滞，并且某些细胞衰老的标志物表达上调。
本课题中我们对这一现象进行更深入的研究。我们提出以下科学假说:干扰rDNA转录过程诱导细胞核仁应激能够诱发血管平滑肌细胞出现衰老的表型，并且能够加速动脉管壁出现动脉瘤样的退行性病理改变。为了验证这一假说，我们主要关注了以下三个方面的科学问题:(1)人AAA组织和小鼠AAA模型中PolⅠ转录复合体关键组分的表达是否发生变化;(2)用平滑肌特异性敲除TIF-IA(PolⅠ转录复合体关键组分之一)的小鼠及特异性PolⅠ抑制剂(CX-5461)为手段，研究干扰rDNA转录、诱导细胞核仁应激是否能加速血管壁动脉瘤样退行性病变的发生发展;(3)在细胞水平阐明干扰rDNA转录诱发核仁应激反应是否加速血管平滑肌细胞出现衰老表型，探索可能的机制，并进一步验证在AAA组织中是否存在以上这些细胞学改变。
研究方法
一、动脉瘤组织中PolⅠ转录复合体关键组分的表达变化及干扰rDNA转录对血管壁动脉瘤样退行性病变发生发展的影响
1.动物模型及分组
选用8周龄ApoE-/-雄性小鼠建立AngⅡ诱导的AAA模型;选用8周龄C57BL/6雄性小鼠建立CaCl2/PBS(Ca/P)诱导的AAA模型。ApoE-/-小鼠被随机分为2组，假手术组和AngⅡ模型组，每组12只。在第7天及第28天取材。将C57BL/6小鼠随机分为2组，PBS对照组和Ca/P模型组，每组12只。在第7天及第28天取材。在药物干预实验中，C57BL/6小鼠被随机分为3组，每组10只，分别为PBS组、Ca/P组和Ca/P+CX-5461处理组(CX+Ca/P)。
2.AngⅡ诱导的AAA模型
将AngⅡ按照1000ng/min/kg的剂量灌入渗透泵中，假手术(Sham)组灌入等量生理盐水。ApoE-/-小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠(40mg/kg)溶液进行麻醉后，小鼠取俯卧位，颈后部备皮后取一长约1cm的横切口，用眼科剪钝性分离背部皮肤与皮下组织，按照分组将渗透泵埋于皮下，将渗透泵置于皮下，逐层缝合切口。待小鼠苏醒后放回鼠笼，给予普通饮食。分别于造模第7天、第28天取材。用qPCR检测血管组织中UBF、TIF-IA、TBP、RPA43(PolⅠ与TIF-IA连接的亚基)mRNA的表达变化。
3.Ca/P诱导的AAA模型
C57BL/6小鼠用小动物麻醉机吸入异氟烷气体进行麻醉，备皮后取下腹部正中切口，找到腹主动脉，仔细分离周围结缔组织，暴露出肾下腹主动脉段(近心端至肾动脉分叉处，远心端至髂动脉分叉处)。将充分浸润CaCl2溶液(0.5M)的棉条覆盖在腹主动脉表面，敷育10分钟。然后换成浸润无菌磷酸盐缓冲液(PBS)的棉条继续敷育5分钟。敷育完毕后用生理盐水冲洗腹腔，用无菌棉球将冲洗液吸干。PBS对照组只敷育浸润PBS的棉条15分钟。逐层缝合组织，待小鼠苏醒后放回鼠笼，术后给予美洛昔康(1 mg/kg)镇痛处理。分别于造模第7天、第28天取材。用qPCR检测血管组织中UBF、TIF-IA、TBP、RPA43mRNA的表达变化。
药物干预实验:CX+Ca/P组在敷育棉条的部位滴加50μL含CX-5461(终浓度10μM)的PluronicF127凝胶。PBS组和Ca/P组滴加等量不含药物的PluronicF127凝胶。待F127凝胶凝固后将肠管复位。术后4周取材，观察腹主动脉血管有无明显膨出并测量其最大直径，对组织切片进行弹性纤维染色(Verhoeffsvangieson染色，简称EVG染色)和苏木素-伊红(HE)染色，对血管弹力层的破坏进行评分并作比较。
4.smTIF-IA-/-小鼠的繁育及表型检测
将雌性TIF-IAflox/flox小鼠和雄性平滑肌细胞骨架蛋白(SMA)启动子驱动的Cre表达小鼠(SMA-Cre)交配繁殖，得到TIF-IA+/-Cre小鼠，再将雌雄TIF-IA+/-Cre小鼠交配繁殖得到平滑肌特异性敲除TIF-IA基因(smTIF-IA-/-)小鼠。取同窝出生的TIF-IA+/+小鼠作为野生型对照。观察小鼠状态、体重，检测并记录小鼠血压。取不同周龄小鼠进行解剖取材，将小鼠主动脉血管进行HE染色及EVG染色并统计血管中膜的平均厚度、观察弹力层形态改变、免疫组化检测平滑肌α肌动蛋白(α-SMA)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、以及巨噬细胞标记物F4/80的表达。
5.人腹主动脉瘤组织标本收集及处理
收集2016年10月至2018年9月于山东大学齐鲁医院行腹主动脉瘤切除加人工血管置换术的患者组织标本。收集2016年11月至2018年3月于山东大学齐鲁医院器官移植中心进行肾脏移植术时部分残留的正常腹主动脉组织作为正常对照。用qPCR检测组织中UBF、TBP、TIF-IAmRNA的表达及pre-rRNA/18SrRNA的比值。Westernblot检测组织中TBP、TIF-IA的蛋白表达。
二、干扰rDNA转录对血管平滑肌细胞衰老的影响及其与动脉瘤病变的关系
1.PolⅠ抑制剂对血管平滑肌细胞衰老表型的影响
分别用两种PolⅠ抑制剂CX-5461和BMH-21处理小鼠平滑肌细胞系(MOVAS)和人主动脉平滑肌细胞(HASMC)。用SA-β-Gal(衰老相关β半乳糖苷酶)染色实验检测衰老细胞的比例，用qPCR检测衰老相关标志物p21Cip1、p16INK4a和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的表达，以及衰老相关分泌因子白介素(IL)-6和IL-8的表达。
2.TIF-IA基因沉默对血管平滑肌细胞衰老表型的影响
用表达shRNA的慢病毒载体敲低MOVAS细胞中TIF-IA基因的表达，用qPCR和Westernblot检测慢病毒干扰效率。用qPCR检测敲低TIF-IA基因对rDNA转录复合体关键因子UBF、polr-1A(编码PolⅠ最大的亚基)和RPA43表达的影响;检测其对p21Cip1、PAI-1、IL-6及IL-8表达的影响。用CellCountingKit-8(CCK-8)和流式细胞术分别检测TIF-IA基因沉默对细胞增殖和细胞周期的影响。
3.TIF-IA基因沉默对平滑肌细胞DNA损伤反应的影响
敲低TIF-IA基因后，用细胞免疫荧光检测MOVAS细胞中核仁磷蛋白(nucleophosmin，NPM)在细胞核中的分布，用Westernblot和/或免疫荧光检测p53蛋白及其磷酸化水平以及ATM、ATR的磷酸化水平。用细胞免疫荧光检测敲低TIF-IA对MOVAS细胞核中磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)和DNA依赖蛋白酶的催化亚单位(DNA-PKCs)水平的影响。用碱性彗星电泳实验检测敲低TIF-1A基因对DNA链断裂的影响。
4.AAA组织中核仁应激、细胞衰老及DNA损伤反应的变化
用qPCR检测人AAA组织中p21Cip1、PAI-1、MMP-2和MMP-9的表达。用免疫组化/免疫荧光检测人AAA中膜组织中DNA损伤通路相关的p53、ATR及ATM/ATR底物S/T*Q的磷酸化水平，检测γH2AX的表达变化并用免疫荧光双标法将γH2AX与α-SMA共定位。为了明确AAA中DNA损伤是否与核仁应激增加有关，对NPM进行了免疫荧光染色，并将NPM和γH2AX进行共定位，对共定位情况进行分析。
在smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜组织中，用免疫组化检测p53及ATR磷酸化水平。用SA-β-Gal染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)实验检测smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜细胞的衰老和凋亡情况。用免疫组化检测组织中PAI-1及IL-8的表达变化。
结果
一、动脉瘤组织中PolⅠ转录复合体关键组分的表达变化及干扰rDNA转录对血管壁动脉瘤样退行性病变发生发展的影响
1.人腹主动脉瘤组织中PolⅠ转录复合体关键组分的表达变化
qPCR检测结果显示，与正常主动脉组织相比，人AAA组织中TIF-IAmRNA表达水平下调，而TBPmRNA表达上调，UBF的表达没有显著改变。Westernblot检测结果显示TIF-IA蛋白表达降低，TBP蛋白表达升高。qPCR检测结果显示45Spre-rRNA与成熟18SrRNA的比率下降。
2.AngⅡ诱导的AAA组织中PolⅠ转录复合体关键组分的表达变化
多普勒超声检测显示，AngⅡ诱导的AAA模型中第7天腹主动脉最大直径增大50％，第28天最大直径增大140％。qPCR结果显示，第7天时UBF、TBP和RPA43的表达水平没有显著改变，而TIF-IA的水平降低。第28天时UBF、TIF-IA的表达水平均降低，而TBP和RPA43表达没有明显变化。
3.Ca/P诱导的AAA组织中PolⅠ转录复合体关键组分的表达变化
HE染色结果显示，Ca/P诱导的AAA模型于第7天开始出现中膜弹性纤维破坏和炎症细胞浸润;第28天中膜弹性纤维破坏加重、出现明显弹力层断裂及炎症细胞浸润。qPCR结果显示，UBF的表达在第7天没有变化，但在第28天显著下降。TIF-IA的表达在第7天和第28天均显著下调。TBP的表达在第7天上调，而在第28天没有明显变化。相比之下，RPA43在两个时间点的表达均无明显变化。
4.smTIF-IA-/-小鼠主动脉璧自发出现动脉瘤样退行性病变
smTIF-IA-/-小鼠在出生时可以存活，但表现出生长迟缓，体重比野生型小鼠约轻10-20％。在4～10周龄时发生自发性死亡，死亡发生前无明显的行为异常。对死亡小鼠进行尸检，未发现腹腔或胸腔出血。组织病理学检查显示，100％的smTIF-IA-/-小鼠在胸、腹主动脉均有广泛的动脉瘤样退行性病变。
组织病理学检查显示血管病变表现为弹力层的紊乱和断裂，平滑肌细胞减少，主动脉血管壁平均厚度降低。免疫组化结果显示，smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜MMP-2和MMP-9表达水平升高。此外，smTIF-IA-/-小鼠主动脉血管周围区域巨噬细胞浸润增加。
5.特异性PolⅠ抑制剂CX-5461加重Ca/P诱导的AAA形成
为了进一步阐明干扰rDNA转录是否在动脉瘤形成中起致病作用，我们在Ca/P模型中腹主动脉周围局部应用CX-5461干预。结果显示，CX-5461增加了Ca/P诱导的AAA发生率。经CX-5461处理的腹主动脉的平均直径明显大于对单纯造模组。组织病理学分析显示，CX-5461处理的腹主动脉中膜弹力层断裂和丢失更为明显。对小鼠血管中膜弹性纤维组织分级统计发现，CX+Ca/P组腹主动脉中膜弹性纤维分级高于CaP组(评分越高组织破坏越显著)。
二、干扰rDNA转录对血管平滑肌细胞衰老的影响及其与动脉瘤病变的关系
1.抑制rDNA转录诱导平滑肌细胞出现衰老样表型
SA-β-Gal染色显示CX-5461(0.5μM)处理MOVAS细胞后衰老细胞比例升高。qPCR结果显示，CX-5461和另外一个PolⅠ抑制剂BMH-21(0.5μM)处理后细胞衰老相关基因p21Cip1、p16INK4a和PAI-1的表达水平与对照组相比均显著升高，同时衰老相关分泌因子IL-6和IL-8的mRNA表达水平也高于对照组。用BMH-21(5μM)处理HASMC细胞同样增加SA-β-Gal阳性衰老细胞的比例。qPCR结果显示，CX-5461(0.5μM)和BMH-21处理HASMC后p21Cip1、p16INK4a和PAI-1的表达水平均显著上调。Westernblot结果显示，BMH-21处理的HASMC中p21Cip1蛋白表达增加。
2.TIF-IA基因沉默诱导MOVAS细胞出现类似衰老的表型
MOVAS细胞中沉默TIF-IA基因表达48小时后，qPCR和Wsternblot检测均显示TIF-IA基因敲低效率大于90％，而PolⅠ复合体其它组分UBF、Polr-1A和RPA43的水平均无明显变化。CCK-8实验结果显示TIF-IA基因敲低后细胞增殖速率减慢。流式细胞术检测结果显示TIF-IA基因敲低诱导细胞出现G2/M期阻滞和S期时相延长。TIF-IA基因敲低组细胞中p21Cip1、PAI-1、IL-6和IL-8的表达水平显著高于对照组。
3.干扰rDNA转录引起平滑肌细胞核仁应激及p53通路激活
细胞免疫荧光结果显示，敲低TIF-IA基因使MOVAS细胞核仁蛋白NPM在核仁/核质中的比例下降，提示NPM出现核仁向核质的弥散。核仁形态改变，出现了核仁帽结构，提示细胞出现核仁应激反应。Westernblot和细胞免疫荧光检测发现TIF-IA基因沉默显著增加了p53(Ser15位)的磷酸化水平，而总的p53蛋白水平没有明显变化。
4.干扰rDNA转录引起的p53磷酸化可能与激活非典型的DNA损伤反应有关
细胞免疫荧光检测结果显示MOVAS细胞中敲低TIF-IA显著增加ATM/ATR的磷酸化水平，同时增加γH2AX和DNA-PKCs阳性细胞的比例。然而用碱性彗星电泳实验检测发现干扰rDNA转录并没有引起广泛的DNA链断裂，提示干扰rDNA转录在血管平滑肌细胞中引起的p53磷酸化可能与激活一种非典型性的DNA损伤反应有关。
5.细胞核仁应激、DNA损伤反应、衰老与动脉瘤病变的关系
qPCR结果显示人AAA组织中PAI-1、p21Cip1、MMP-2和MMP-9的表达均上调，表明细胞衰老水平增加。根据α-SMA免疫组化结果选取中膜富含平滑肌细胞的区域进行观察，NPM免疫荧光染色显示AAA组织中核仁形态异常(表现为NPM荧光信号弥散)的细胞数量增加。免疫组化结果显示p53磷酸化(Ser15)水平在AAA组织中显著升高。在AAA组织中，细胞核中γH2AX染色阳性细胞的比例显著增加。免疫荧光结果显示phospho-ATR阳性细胞比例比对照血管组升高。此外，ATM/ATR底物功能域S/T*Q的磷酸化水平在AAA组织中也呈增加趋势。深入分析γH2AX和NPM免疫荧光双标结果发现，一半以上的γH2AX阳性细胞中γH2AX与弥散的NPM呈现共定位。没有γH2AX-NPM共定位的γH2AX阳性细胞中，大部分核仁结构完好(没有核仁应激现象))。这些结果提示在AAA组织中细胞p53磷酸化水平增加伴随核仁应激增加和DNA损伤反应增加，而且DNA损伤反应的发生部分定位于核仁内，提示可能与rDNA有关。
为进一步验证以上结果，我们在smTIF-IA-/-小鼠主动脉中进行观察，SA-β-Gal染色显示smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜中衰老细胞数量增多。免疫组化结果显示smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜细胞p-p53和p-ATR阳性细胞比例增高，同时IL-8和PAI-1表达增多。相反，TUNEL染色结果显示与野生型小鼠相比，smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜中细胞凋亡没有发生明显改变。
结论
动脉瘤组织中PolⅠ转录复合体关键组分的表达水平出现差异性改变。整体情况下干扰平滑肌细胞rDNA转录过程加速血管壁动脉瘤样退行性病变的发生发展。在体外，干扰平滑肌细胞rDNA转录过程，诱导细胞核仁应激，可能通过触发非典型性DNA损伤反应激活p53通路，进一步导致平滑肌细胞出现衰老样表型。在人AAA组织中膜中细胞p53磷酸化水平增加，并伴随核仁应激增加和DNA损伤反应增加，而且DNA损伤反应的发生部分定位于核仁内，提示可能与rDNA有关。
创新性及意义
1.首次揭示了rDNA转录障碍可能参与动脉瘤的发生发展。
2.构建的平滑肌细胞特异性TIF-IA基因敲除小鼠可能作为研究动脉瘤样病变发生的新型动物模型。
局限性
1.在体内实验中尚未完成针对细胞衰老进行的干预实验。
2.在体外实验中没有观察抑制DNA损伤反应对平滑肌细胞衰老的影响，不能确立诱发的非典型性DNA损伤反应与细胞衰老之间的因果联系。