SpyLigase系统是以SpyTag/SpyCatcher连接反应为基础,经过合理改造得到的,由肽标签KTag、肽标签SpyTag和连接酶SpyLigase构成的肽-肽连接系统,其中KTag和SpyTag均可与SpyLigase自发结合,形成异肽键。SpyLigase系统可以在对蛋白分子进行最小修饰的情况下,进行蛋白分子的连接,这对于多酶复合体、超分子的构建、蛋白构型的多样性有着重要的理论意义,蛋白工程和生物医药产业可以应用SpyLigase系统构建多种构型的蛋白、酶及缓释蛋白药物。目前,SpyLigase系统在大肠杆菌(Escherichia coli)中只进行过单组分基因表达,该连接反应是在体外进行的;该系统没有在真核生物细胞内验证过。本论文以真核生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为宿主,验证SpyLigase系统在真核生物中的有效性。实验首先构建了三个质粒,分别是含编码Cu2+诱导的启动子和带有KTag标签和His标签的绿色荧光蛋白基因的YEplac195-PT-RKTHA、含编码Cu2+诱导的启动子和带有SpyTag的红色荧光蛋白基因的YEplac181-PT-HSTeG以及含编码Cu2+诱导的启动子和SpyLigase基因的YEplac112-PSLT。然后将三个质粒共转化酿酒酵母,构建目的菌株,并设置1组阴性对照和3组阳性对照。通过在对照阴性对照菌株和阳性对照菌株1、2的对数生长中后期添加Cu2+诱导质粒启动子的表达,孵育一定时间后,对菌体分别进行荧光镜检,确认空质粒不会影响实验且转化质粒可在酿酒酵母中正常表达。然后,通过在菌株对数生长中后期添加Cu2+诱导质粒启动子的表达,孵育一定时间后,提取菌体全蛋白,并对全蛋白进行His标签蛋白的纯化,然后分别进行荧光镜检。通过观察纯化蛋白的绿色荧光和红色荧光,并与阳性对照3纯化后的蛋白进行对比,确认了 SpyLigase系统在酿酒酵母中的有效性。