论文部分内容阅读
目的：脱氢醋酸钠(DHA-S)具有良好的防腐保鲜作用,作为食品防腐剂及饲料防霉剂被广泛应用。DHA-S具有与华法林相似的双香豆素结构,华法林通过拮抗VK而起到抗凝血作用。资料报道DHA-S应用有出血倾向,本课题组在DHA-S作为饲料添加剂使用的毒理学研究中也发现,可明显影响大鼠和家兔的凝血功能,内脏器官有出血现象。本文通过DHA-S给予大鼠的饲喂试验,通过检测凝血指标凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT),血清中VK水平,以及肝脏中维生素环氧化酶(VKOR)的蛋白和mRNA 水平,凝血酶原前体蛋白(PIVKA-Ⅱ)水平,以及体外对VKOR酶活力的影响,研究DHA-S引起大鼠出血(倾向)的VKOR机制。方法：Wistar大鼠灌胃给予DHA-S,剂量设置设为50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg和200 mg/kg四个剂量组,以生理盐水为正常对照。每组大鼠40只,公母各半。分别在给予DHA-S后5 d、7 d、9 d、11 d、13 d,每组公母大鼠各4只取血清和肝脏样品。另设VK干预：在给予DHA-S 14d和16d时,1 mg/100g b.w.腹腔注射VK1,于注射后24 h和48 h取血清和肝脏备用。ELISA法检测大鼠血清VK和PIVKA-II的含量,应用Western Blot和RT-PCR检测肝脏中VKORC1的蛋白和mRN A水平。利用大鼠肝微粒体酶进行体外酶促反应试验,2mmol/L、5 mmol/L、10mmol/L、50mmol/L的DHA-S加入酶促反应体系中,通过测定OD560nm评价VK环氧化物(VKO)转化为VK的水平,以酶活力比值表示DHA-S对大鼠肝微粒体中、/KOR酶活力的影响。结果：大鼠给予DHA-S 150 mg/kg和200mg/kg后5-13 d,PT值显著延长,是正常对照组的2-3倍,150 mg/kg和200 mg/kg间无显著差异。APTT在5～13d也显著延长,约是正常对照组的1-3倍,200 mg/kg组显著高于150mg/kg组。VK干预后PT和APTT均显著下降。50～200 mg/kg DHA-S给予大鼠后,血清VK水平均有不同程度降低,150ng/kg和 200 mg/kg组在5-15 d内,VK水平显著低于正常对照组(P<0.01)。VK注射后,血中VK水平极显著升高。大鼠肝微粒体酶体外酶促反应试验中,100VKO为酶促反应体系中较适的VKOR底物浓度；5～50 mmol/mL DHA-S组酶活力极显著降低(P<0.01),随DHA-S剂量增加酶活力下降越多。50 mmol/mL DHA-S组酶活力下降约一半。2 mmol/mL组差异不显著。DHA-S对■ KOR的影响可用二项式曲线y=0.00083x2+0.9923拟合,R2=0.98502,ICso为11.67mmol/L。肝脏免疫组化VKORC1蓝紫色阳性主要分布在细胞浆中。不同剂量DHA-S处理大鼠后,肝脏VKORC1蓝紫色阳性细胞有所减少。Vestern Blot检测结果显示大鼠经DHA-S处理后,V KORC1表达量与正常对照组相比均有明显下降。雌性大鼠VKORC1表达量显著低于雄性大鼠。DHA-S各剂量组随着灌服天数的增加,VKORC1的表达量显著降低,150 mg/kg和200 mg/kg剂量组降低极显著。VK处理后各剂量组VKORC1表达量显著上升。RT-PCR检测VKORC1基因mRNA水平,结果与、estern Blot检测结果相似。不同剂量DHA-S处理大鼠后,肝脏、KORC1基因mRNA水平,与正常对照组相比,均显著下降(P<0.01),且雌性大鼠VKORC1基因mRNA水平显著低于雄性大鼠。DHA-S各剂量组随着灌服天数的增加,VKORC1 mRNA水平显著降低,150 mg/kg和200 mg/kg剂量组降低极显著。应用维生素K处理之后,VKORC1基因表达量有所上升。不同剂量DHA-S处理大鼠后,血清中PIVKA-Ⅱ的含量有所增加,在13d时差异极显著(P<0.01),其他时间差异不显著。VK注射后24 h和48 h后,PIVKA-Ⅱ水平值显著降低。结论：150 mg/kg～200 mg/kg DHA-S可引起大鼠血凝指标延长,有出血倾向。DHA-S引起大鼠出血与抑制VKOR的酶活力及VKORC1的表达,影响VK循环,从而降低血中VK水平及增加PIVKA-Ⅱ表达有关。