蛋白质的泛素化是细胞内降解蛋白质的主要途径,泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)降解了胞内约80%的蛋白质且本身具有高度的特异性。泛素化过程需要泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的共同作用。SCF-E3泛素连接酶是E3泛素连接酶中最大的家族,在UPS中主要负责识别大量特异性靶蛋白,参与调节胞内多种生理过程,包括调节信号转导﹑细胞周期﹑细胞凋亡﹑DNA修复等过程。目前的一些研究证明蛋白酶体参与鞭毛/纤毛的解聚过程,因此我们推断同样参与蛋白降解的泛素连接酶可能也参与到这一过程。鞭毛和纤毛在进化上十分保守并且拥有十分类似的结构,是一种细胞基体突出于细胞表面的细胞器。鞭毛和纤毛不仅能够作为细胞的运动推进器,也可以作为细胞感受器,接受外界环境或周围细胞的生化信号并传递到细胞内。已有研究表明人类几乎所有的细胞都具有纤毛,然而人类细胞纤毛较短且不容易处理,故不易作为研究对象。在模式生物衣藻中鞭毛内运输最早被发现,随后这种机制也被证明存在于高等动物纤毛中。一些信号通路中重要的信号分子受体也存在于纤毛上,如PDGFαα受体,此外Wnt、Hedgehog和mTOR等信号通路也与纤毛有关。与正常细胞相比在肿瘤细胞中纤毛更容易丢失,目前在肾癌、食管癌、乳腺癌和胰腺癌细胞中已经发现了这一现象。然而纤毛在肿瘤中的缺失机制尚未完全清晰。鞭毛/纤毛的解聚需要大量纤毛相关蛋白的降解,虽然蛋白酶体已被证实参与纤毛的解聚,然而泛素连接酶相关蛋白是否参与纤毛的解聚,并且影响肿瘤的发生发展尚有待探索。杜氏盐藻和衣藻同为真核单细胞绿藻,然而由于杜氏盐藻鞭毛比衣藻鞭毛少了一层细胞壁,更适合作为研究鞭毛的模式细胞器,因而本实验以杜氏盐藻鞭毛作为研究对象,来检测E3泛素连接酶亚基RBX1(Ring box protein-1)与鞭毛间的关系RBX1是SCF-E3泛素连接酶中的指环亚基,而SCF-E3泛素连接酶是最大的E3连接酶家族,能够调节多种生理生化过程。SCF-E3泛素连接酶能够促进多种细胞内蛋白的降解,包括一些转录因子,细胞周期调节因子和信号转导因子等。RBX1蛋白在N端结合cullins蛋白,在C端通过指环结构域和连接泛素的泛素结合酶E2结合,最终催化将泛素转移到目的蛋白进而降解。研究发现在多种生物中,RBX1由于调节细胞的增殖和分化对于许多生物的胚胎发育十分重要。此外,RBX1在多种肿瘤中发生过表达并且调控着肿瘤细胞的增殖和凋亡,如胃癌、肝癌以及膀胱癌等。为了了解E3泛素连接酶在纤毛中的功能,并寻找食管鳞癌的治疗靶点,本研究以杜氏盐藻鞭毛作为模式细胞器,研究SCF-E3泛素连接酶亚基RBX1与鞭毛解聚间的关系,并进而研究RBX1对食管鳞癌细胞纤毛的影响以及对细胞增殖和凋亡的影响。第一章杜氏盐藻RBX1多克隆抗体的制备目的:为了探究杜氏盐藻鞭毛解聚过程中SCF-E3泛素连接酶的变化,以杜氏盐藻鞭毛为模式细胞器初步研究RBX1是否参与杜氏盐藻鞭毛的解聚,我们需要首先克隆杜氏盐藻RBX1(DsRBX1)基因并制备抗体。方法:依据实验室前期转录组测序结果,设计引物克隆杜氏盐藻RBX1基因cDNA片段,并应用3’-RACE的方法克隆杜氏盐藻RBX1基因3’cDNA末端,通过拼接获得DsRBX1基因cDNA序列全长,进一步设计引物克隆基因全长,测序验证并进行生物信息学分析。进而将Ds RBX1基因cDNA编码区序列克隆到pET28a(+)载体上,得到重组表达载体pET28a-DsRBX1,转化进入表达菌株BL21(DE3)中,通过表达和纯化得到DsRBX1蛋白。将DsRBX1蛋白与弗氏佐剂混合乳化,进而对健康日本大耳兔进行皮下多点注射接种,第五次免疫后一周颈静脉取血收集血清。利用酶联免疫吸附法检测血清中抗体的滴度。结果:依据转录组测序结果,克隆得到杜氏盐藻RBX1基因cDNA片段504bp,并应用3’-RACE的方法克隆杜氏盐藻RBX1基因3’cDNA末端455 bp,通过拼接获得DsRBX1基因cDNA序列全长860 bp,经过序列分析,包含411 bp的开放阅读框。该序列能够编码136个氨基酸残基,分子量约为14.8 kD。经过生物信息学分析,揭示该序列与已知的其它物种RBX1具有高度同源性。将DsRBX1基因cDNA编码区序列克隆到pET28a(+)载体,得到重组表达载体pET28a-DsRBX1,转化进入表达菌株BL21(DE3)中,通过表达和纯化得到DsRBX1蛋白。纯化的蛋白用于制备多克隆抗体,利用酶联免疫吸附法检测制备的血清中抗体的滴度,显示兔抗DsRBX1多抗的效价达到1:512000。结论:克隆得到在进化中高度保守的DsRBX1基因全长序列,重组表达得到DsRBX1蛋白,进而制备了DsRBX1的多克隆抗体。第二章RBX1对杜氏盐藻鞭毛调控作用的初步研究目的:为了探究杜氏盐藻鞭毛解聚过程中SCF-E3泛素连接酶的变化,以杜氏盐藻鞭毛为模式细胞器初步研究SCF-E3泛素连接酶亚基RBX1是否参与杜氏盐藻鞭毛的解聚。方法:用收集得到的兔抗DsRBX1多克隆抗体,测定DsRBX1蛋白在杜氏盐藻鞭毛经1 mM IBMX诱导解聚后的变化。分别提取2小时内鞭毛解聚后的杜氏盐藻RNA和蛋白,从而检测杜氏盐藻鞭毛解聚时DsRBX1在RNA水平和蛋白水平上的变化。结果:IBMX诱导杜氏盐藻鞭毛解聚后,杜氏盐藻鞭毛在2小时后又基本恢复正常长度。RT-PCR和Western blotting结果均显示DsRBX1蛋白显著升高后又逐渐恢复正常水平。结论:在杜氏盐藻鞭毛解聚过程中DsRBX1表达水平显著升高,说明DsRBX1参与杜氏盐藻鞭毛的解聚。第三章RBX1在食管鳞癌发生发展中的作用目的:为了研究SCF-E3泛素连接酶亚基RBX1在食管鳞癌发生发展中的作用,我们检测了RBX1在食管鳞癌细胞中的表达情况,以及干扰后对食管鳞癌细胞增殖凋亡及细胞纤毛的影响。方法:通过Western blotting检测RBX1蛋白在正常食管上皮细胞Het-1A和三株食管鳞癌细胞系EC9706、EC1、Eca109中的表达水平。构建RBX1的shRNA慢病毒干扰三株食管鳞癌细胞中RBX1的表达,检测对三株细胞增殖、周期、凋亡以及侵袭能力的影响,并检测了RBX1干扰后食管鳞癌细胞中纤毛数量的变化。同时在裸鼠背部接种干扰RBX1后的食管鳞癌细胞EC9706,构建裸鼠移植瘤模型,检测干扰RBX1对食管鳞癌细胞致瘤能力的影响,致瘤三天左右开始测量肿瘤大小,最终计算肿瘤抑制率及绘制肿瘤组织的生长曲线,病理组织分析移植瘤的细胞形态并用TUNEL法检测肿瘤组织的细胞凋亡水平。结果:Western blotting检测结果显示,RBX1蛋白在三株食管鳞癌细胞系EC9706、EC1、Eca109中的表达量均高于正常食管上皮细胞Het-1A中的表达。shRNA慢病毒干扰三株食管鳞癌细胞中RBX1的表达,结果显示细胞增殖及侵袭能力降低,细胞凋亡率增加,同时检测到干扰后食管鳞癌细胞中纤毛数量明显恢复。在构建的裸鼠移植瘤模型中,干扰RBX1后的食管鳞癌细胞EC9706生长受抑制,肿瘤体积缩小到对照组的约1/2,病理组织检测显示成瘤细胞异质性降低,TUNEL显示干扰RBX1的组织中细胞凋亡增加。结论:RBX1蛋白在食管鳞癌细胞中表达增高,干扰RBX1的表达能显著抑制细胞增殖,促进细胞凋亡并抑制细胞的侵袭能力,并且细胞纤毛也明显恢复,进一步在构建的裸鼠移植瘤模型中干扰RBX1,食管鳞癌移植瘤体积明显减小。第四章RBX1调控食管鳞癌发生的分子机制目的:为了研究SCF-E3泛素连接酶亚基RBX1在食管鳞癌发生发展中的作用,我们进一步检测了影响食管鳞癌细胞增殖凋亡及细胞纤毛变化的重要蛋白分子的变化。方法:通过Western blotting,分别检测RBX1干扰后影响食管鳞癌细胞迁移的蛋白E-cadherin,影响细胞凋亡的抗凋亡蛋白Bcl-2及影响细胞纤毛的纤毛相关蛋白Aurora A,并检测mTOR信号通路中关键分子的表达情况,进一步通过在正常食管上皮细胞Het-1A中过表达RBX1检测对mTOR信号通路的影响。结果:通过Western blotting检测显示,与shCon干扰后的食管鳞癌细胞相比,E-cadherin在shRBX1干扰后的细胞中表达明显升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下调,而mTOR信号通路中关键分子Akt,mTOR和p70S6K及其磷酸化形式的表达均受到抑制。而且在正常食管上皮细胞Het-1A中过表达RBX1后,mTOR信号通路中mTOR和p70S6K蛋白表达又明显升高。结论:干扰RBX1的表达能显著抑制食管鳞癌细胞的增殖,促进细胞凋亡并抑制细胞的侵袭能力,并且使细胞纤毛明显恢复,这些可能是分别通过重要分子E-cadherin,Bcl-2,Aurora A和mTOR信号通路调控的。