肌腱病(tendinopathy)在体育训练及日常生活中十分常见,它是骨科和运动医学当中最常见的一类运动损伤性疾病,包括跟腱病、网球肘、肩袖损伤、冈上肌腱炎等30多种。肌腱因其寡细胞、寡血供和寡神经支配的特点使得其在损伤后往往不能恢复正常组织结构,而是由瘢痕组织修复来代替,损伤肌腱瘢痕修复后不具备正常肌腱的生物力学性能,且损伤部位常常出现脂肪浸润、异位钙化及疼痛等并发症,再损伤甚至再断裂发生率较高。近年来,肌腱病的发病率逐年提高,其占到所有运动损伤性疾病的50%以上,其中14%的专业运动员饱受肌腱病的困扰,除了在长期反复应用肌腱的运动人群中常见外,遗传因素和基因突变等往往使得一些个体更容易出现肌腱相关疾病。由于治疗策略及疗效有限,一线保守治疗后往往需要3-6个月的康复时间,有大约24~45.5%的患者会发展为难治性肌腱病,这极大的影响了专业运动员的成绩和病人的日常生活质量,也为家庭和整个社会带来了巨大的经济负担,因此针对肌腱病治疗开展深入研究也就势在必行。肌腱干细胞(tendon stem cells,TSCs)于2007年在小鼠和人肌腱中被首次发现,作为肌腱细胞的前体细胞,其具有与间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)相似的生物学功能但又区别于MSCs具有自己独特的标志物,其具有多向分化潜能且分化能力强,可向成肌腱、成脂肪、成骨和成软骨等多方向分化,目前已有很多学者报道了其可直接参与肌腱损伤的再生与修复过程。促进TSCs向成肌腱方向分化和抑制病理状态下TSCs的非成肌腱方向(成脂肪、成骨和成软骨分化)分化是目前治疗肌腱病损伤修复的有效策略。基于上述问题和现状,我们可以明确TSCs的增殖、凋亡、分化及其所处微环境的变化对肌腱病发生、发展及愈合过程有着重要的意义,任何影响其上述生物学功能的因素都势必会影响病腱损伤修复的预后。目前针对肌腱病的治疗包括减少运动量和改变不恰当的运动方式、口服非甾体类抗炎药(non-steroid anti-inflammatory drugs,NSAIDs)、局部激素注射、体外冲击波治疗、细胞学(富含血小板血浆注射、干细胞注射)和组织工程学治疗(支架材料+干细胞移植)等,其中NSAIDs因其具有抗炎和镇痛的作用,是临床中保守治疗肌腱病最常用以及病人依从性最好的一种保守治疗措施。然而,除了其抗炎和镇痛的作用,NSAIDs对TSCs生物学行为以及对肌腱病损伤修复的作用和相关机制目前尚不明确,针对上述问题的阐述有助于为临床提供更加可靠的NSAIDs治疗肌腱病的用药依据,也可为临床合理应用NSAIDs提供初步参考。阿司匹林(aspirin,ASA)作为NSAIDs的最经典代表药物已被广泛用于抗肿瘤、抗凝等多个领域,其对多种类型干细胞分化的作用影响也有报道,那么其是否对肌腱病损伤修复和TSCs多向分化有调节作用?如果有促修复作用具体机制又是什么?是否通过调节TSCs的多向分化而实现上述过程?围绕上述问题我们开展本研究。本研究首先筛选相对安全的阿司匹林给药浓度,然后拟观察阿司匹林对大鼠跟腱病损伤修复的作用,最后阐述阿司匹林通过调节TSCs的多向分化而促进大鼠肌腱病损伤修复的机制。1阿司匹林对TSCs凋亡的影响本章研究通过观察不同浓度阿司匹林对TSCs凋亡的影响结合临床实际用药剂量,筛选出相对安全的给药剂量,同时阐述相关信号通路在凋亡过程中的作用。1.1实验方法1.1.1设置阿司匹林浓度梯度,根据临床实际用药浓度、查阅相关国内外文献并结合其可能的与组织修复相关的作用,分别为0、0.25、0.5、1、2、5m M,对TSCs处理24h;时间依赖实验设置时间节点,分别为0、1、2、4、8、12、16、20、24h,浓度为5m M。1.1.2通过Hoechst33342细胞核染色和FITC/PI流式细胞学分析来检测TSCs的凋亡情况。1.1.3通过Western blot(WB)来观察凋亡相关线粒体通路蛋白Bcl2、Bax以及Cleavaged(Cl).Caspase3表达变化情况。1.1.4通过WB来观察经典Wnt/β-catenin通路相关蛋白DKK1、P-GSK-3β、P-β-Catenin、C-myc和Cyclin D1表达变化情况。1.1.5在TSCs中加入经典Wnt/β-Catenin通路激活剂Wnt3a和Li Cl后,通过WB来观察Wnt通路相关蛋白和凋亡相关线粒体通路蛋白的表达变化情况。1.1.6在TSCs中加入经典Wnt通路激活剂Wnt3a和Li Cl后,通过Hoechst33342和流式细胞学技术来观察凋亡变化情况。1.1.7通过WB技术来观察阿司匹林对COX-2表达的影响,同时观察加入COX-2抑制剂NS398后凋亡相关蛋白Cl.Caspase-3表达变化情况。1.1.8通过Hoechst33342和流式细胞学检测来观察在阿司匹林处理基础上,加入NS398后观察凋亡变化情况。1.2实验结果1.2.1从浓度依赖和时间依赖性来看,阿司匹林分别增加了Hoechst33342(+)细胞数量和FITC(+)/PI(+)的细胞数量,尤其在阿司匹林在浓度5m M时凋亡率超过40%,尽管1和2m M下阿司匹林同样有诱导凋亡的作用,但结合其临床有效作用浓度,0~2m M可被认为是相对安全给药浓度。在加入经典Wnt通路激活剂Li Cl和Wnt3a后,上述阳性细胞数量减少。1.2.2从浓度依赖和时间依赖性来看,加入阿司匹林后,凋亡标志蛋白Bax和Cl.Caspase-3的表达升高,凋亡拮抗蛋白Bcl2表达降低。并在加入经典Wnt通路激活剂Li Cl和Wnt3a后,上述蛋白表达趋势得到逆转。1.2.3从浓度依赖和时间依赖性来看,加入阿司匹林后,经典Wnt通路上游抑制剂DKK1表达升高,通路相关蛋白P-β-Catenin表达升高,P-GSK-3β、Cyclin D1和C-myc表达降低,并在加入Wnt通路激活剂Li Cl和Wnt3a后,上述蛋白表达趋势得到逆转。1.2.4阿司匹林促进了COX-2的表达,在加入NS398后,Hoechst33342(+)细胞数量和FITC(+)/PI(+)的细胞数量减少,Cl.Caspase-3的表达升高。1.3小结1.3.1确立了相对安全给药剂量为0~2m M,为后续实验提供了给药浓度。2阿司匹林对大鼠肌腱病损伤修复的作用本章研究在前一章所筛相对安全给药剂量基础上,观察阿司匹林对大鼠肌腱病损伤修复的作用。2.1实验方法2.1.1大鼠跟腱病动物模型的建立24只雄性大鼠,腹腔麻醉后,于右侧跟腱中点部位给予10mg/ml I型胶原酶注射,左侧注射PBS作为对照组。2.1.2阿司匹林的治疗经过1周急性炎症期后给予阿司匹林喂服治疗,喂服剂量为30mg/d,持续时间为4周。实验分组具体为:对照组、肌腱病损伤组、肌腱病阿司匹林治疗组,每组8只大鼠,治疗4周后收集跟腱进行后续实验。2.1.3体外细胞炎症模型的建立于6孔板中种植TSCs细胞(6万/孔),添加IL-1β(10ng/ml)用来体外建立炎症模型,具体实验分组为:对照组、IL-1β组、ASA组、IL-1β+ASA(2m M)组,处理时间为24h。2.1.4阿司匹林对损伤跟腱巨噬细胞表型和炎症因子表达的影响动物实验部分,阿司匹林治疗4周后收集跟腱。通过免疫组化观察I型巨噬细胞标志物i NOS、单核细胞标志物CD14和II型巨噬细胞标志物CD206表达的变化;同时观察炎症因子IL-6和抗炎因子IL-10的变化。细胞实验部分,4组细胞在处理24h后通过q RT-PCR来观察IL-6和IL-10因子的变化。2.1.5阿司匹林对损伤肌腱外基质合成和分解的影响动物实验部分,治疗4周后收集跟腱。通过免疫组化观察MMP-3、TIMP-3和Col-I的变化;细胞实验部分,通过q RT-PCR分析MMP-3、TIMP-3和Col-I的表达变化。2.1.6阿司匹林对肌腱损伤后瘢痕相关标志物表达的影响动物实验部分,在治疗4周后收集跟腱组织,通过免疫荧光观察瘢痕相关标志物Biglycan、COMP、Fibronectin和TGF-β1的表达变化;细胞实验部分,通过q RT-PCR观察ACAN、COMP、EGR-1和FMOD的表达变化。2.1.7阿司匹林对TSCs增殖和迁移能力的影响通过划痕实验观察在IL-1β的处理下,经过阿司匹林的治疗后,TSCs迁移能力的变化;通过Brd U实验观察在IL-1β的诱导下,经过阿司匹林处理后,TSCs增殖的变化。2.1.8阿司匹林对跟腱损伤愈合和生物力学的影响动物体内实验,通过免疫荧光观察经过阿司匹林治疗后损伤肌腱Col-I/Col-III的变化情况;通过跟腱牵拉实验,观察损伤跟腱经过治疗后生物力学性能的变化。2.2实验结果2.2.1动物实验,免疫组化结果显示,相比损伤组,经过阿司匹林治疗后,I型巨噬细胞和单核细胞数量减少,而II型巨噬细胞增多;促炎因子IL-6减少,抗炎因子IL-10增多;基质金属蛋白酶MMP-3表达降低,组织相关金属蛋白酶抑制剂TIMP-3表达升高,跟腱修复指标Col-I表达升高。2.2.2细胞实验,PCR结果显示相比IL-1β组,阿司匹林组治疗后,IL-6和MMP-3表达降低,IL-10、TIMP-3和Col1a1表达升高。2.2.3动物实验,免疫荧光结果显示,相比损伤组,经过阿司匹林治疗后,瘢痕标志物Biglycan、COMP、Fibronectin和TGF-β1表达降低;细胞实验,PCR结果显示,相比IL-1β组,经过阿司匹林治疗后,ACAN、COMP、EGR-1的表达降低,而瘢痕抑制因子FMOD的表达升高;Col-1/III的比例相比损伤组有明显提升。2.2.4细胞划痕实验,IL-1β促进了TSCs的迁移,而经过阿司匹林处理后,TSCs的迁移能力得到逆转;细胞增殖Brd U实验结果示,IL-1β促进了TSCs的增殖,而加入阿司匹林后则抑制了TSCs的过度增殖。2.2.5跟腱牵拉试验结果提示,相比损伤组,经过阿司匹林治疗后,最大拉断力和杨氏模量都得到明显提升。2.3小结2.3.1阿司匹林促进了病腱损伤修复过程。2.3.2阿司匹林提升了病腱的生物力学性能,降低了再断裂发生风险。3阿司匹林对TSCs成肌腱分化的影响本章研究在前面两章研究基础上探究阿司匹林是否通过调节TSCs成肌腱分化而促进病腱损伤修复的机制。3.1实验方法3.1.1细胞体外实验,在成肌腱诱导培养基基础上,根据阿司匹林的浓度分组为:0、0.25、0.5、1、2m M,天狼星红染色观察各组成肌腱水平。3.1.2以2m M阿司匹林为基础,分别成肌腱诱导3、7和14天,通过q RT-PCR观察成肌腱指标SCX、TNMD和TNC的变化,通过WB观察3个时间点TNC、TNMD和SCX的表达变化。3.1.3通过m RNA测序观察成肌腱诱导组和诱导+阿司匹林组,筛选出两组间的分子变化;通过WB和PCR来验证所筛分子是否跟m RNA测序结果一致。3.1.4通过m RNA测序、WB和PCR结果,筛选出目的分子,向TSCs细胞中加入目的蛋白分子,分别通过天狼星红染色、WB和PCR来验证目的蛋白分子对成肌腱分化标志物Col-1、TNMD、SCX和TNC表达的变化。3.1.5通过WB观察两组细胞(诱导组和诱导+阿司匹林组)之间在3天、7天和14天P-Smad1/5的变化,同时验证筛选目的蛋白分子对P-Smad1/5的影响以及加入其抑制剂后P-Smad1/5的变化。通过天狼星红染色、WB和PCR观察加入目的蛋白因子和抑制剂后成肌腱分化标志物TNMD、SCX表达的变化。3.1.6对于动物学实验,通过I型胶原酶造跟腱病损伤模型1周后,阿司匹林治疗4周后,HE染色来观察造模及治疗效果,同时给予进行组织学评分;通过免疫荧光观察成肌腱标志物SCX、TNMD和TNC的表达变化;通过对正常跟腱组、肌腱病组和肌腱病阿司匹林治疗组跟腱的牵拉实验,分析三组跟腱生物力学性能包括最大拉断力、终断压强和拉断伸长率的变化。3.2实验结果3.2.1对于细胞实验,随着阿司匹林浓度的增加,天狼星红染色面积及成梭形形态的细胞阳性率增加;PCR和WB结果示在3天、7天和14天,SCX、TNMD和TNC分别不同程度的表达升高。3.2.2 m RNA测序结果提示,两组别之间筛选出差别分子生长分化因子6(growth differentiation factor 6,GDF6)、GDF7和GDF11;通过WB和PCR验证提示,GDF7和GDF11表达升高,而GDF6变化没有统计学意义,因而舍弃GDF6。3.2.3进一步验证GDF7和GDF11对TSCs成肌腱分化的影响,天狼星红染色、WB和PCR结果示,GDF7可以促进成肌腱分化水平,而GDF11对成肌腱分化的影响不大,因而舍弃GDF11。3.2.3 GDF7增加了P-Smad1/5的磷酸化水平,其抑制剂LDN193189则逆转了该趋势,以上通过天狼星红染色、WB和PCR验证。3.2.4对于动物体内实验,组织学评分显示经过阿司匹林治疗后病腱评分明显升高,HE镜下可见跟腱排列更加有序;免疫荧光结果提示SCX、TNMD和TNC表达在治疗组分别增加;跟腱牵拉实验结果提示经过阿司匹林治疗后,生物力学性能得到明显提升。3.3小结3.3.1阿司匹林通过调节GDF7/Smad1/5通路来促进TSCs的成肌腱分化。3.3.2阿司匹林通过促进TSCs的成肌腱分化而促进病腱损伤的修复。4阿司匹林对TSCs成脂肪分化的影响本章研究在前面三章基础上继续探讨阿司匹林促进病腱修复的机制,是否通过调节TSCs成脂肪分化和成骨分化而实现其促损伤修复的作用。4.1实验方法4.1.1细胞体外实验,在成脂肪诱导培养基基础上,根据阿司匹林的浓度分组为:0、0.25、0.5、1、2m M,处理24h,油红O染色观察各组成脂肪分化水平。4.1.2以2m M阿司匹林为基础,分别成脂肪诱导3、7和14天,通过PCR观察成脂肪分化指标ap2、PPARγ和C/EBPα的变化,通过WB观察3个时间点ap2、PPARγ和C/EBPα的表达变化。4.1.3通过m RNA测序观察成脂肪分化诱导组和诱导+阿司匹林组,筛选出两组间差异显著分子;通过WB来验证所筛选信号通路是否跟m RNA测序结果一致。4.1.4通过m RNA测序筛选、WB结果验证得出相关信号通路,向TSCs细胞中加入该通路的激活剂或者抑制剂,分别通过油红O染色和WB来观察成脂肪分化的变化,PPARγ表达的变化。4.1.5对于动物学实验,通过I型胶原酶造跟腱病损伤模型后,阿司匹林治疗4周,HE染色来观察造模、治疗效果和脂肪的变化情况,同时进行组织学评分;通过免疫荧光观察成脂肪分化标志物ap2和PPARγ的表达变化;通过对正常跟腱、模型组病腱、治疗组跟腱三组跟腱的牵拉实验,分析三组跟腱生物力学性能包括最大拉断力、终断压强和拉断伸长率的变化。4.2实验结果4.2.1对于细胞实验,随着阿司匹林浓度的增加,油红O染色脂肪形成显著降低;q PCR和WB结果示在3天、7天和14天,ap2、PPARγ和C/EBPα分别不同程度的表达降低。4.2.2 m RNA测序结果示,两组别之间筛选出有差异的信号通路PTEN/PI3K/AKT通路;向TSCs中加入通路抑制剂VO-Ohpic和IGF-1后通过WB验证提示,阿司匹林可以激活该通路。4.2.3进一步验证阿司匹林是否通过激活PTEN/PI3K/AKT通路来抑制TSCs成脂肪分化的影响,油红O染色和WB结果示,阿司匹林通过激活PTEN/PI3K/AKT通路抑制了TSCs的成脂肪分化,加入该通路抑制剂VO-Ohpic和IGF-1后,成脂肪抑制趋势得到逆转。4.2.3对于动物体内实验,组织学评分显示经过阿司匹林治疗后的病腱评分明显升高,HE镜下可见跟腱排列更加有序,脂肪聚集浸润明显减少;免疫荧光结果提示ap2和PPARγ在治疗组分别减少;跟腱牵拉实验结果提示经过阿司匹林治疗后,生物力学性能得到明显改善。4.3小结4.3.1阿司匹林通过调节PTEN/PI3K/AKT通路来抑制TSCs的成脂肪分化,抑制成骨分化。4.3.2阿司匹林通过抑制TSCs的成脂肪分化和脂肪浸润而促进病腱损伤的修复。