亚洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)]是我国玉米生产的最主要害虫，平均每年给我国造成产量损失600-900万吨。为了有效防治这种害虫，尽量减少对环境和植物本身的影响，在本研究中，用cDNA-AFLP(cDNA-amplifiedfragmentlengthpolymorphism)技术克隆在玉米穗期幼嫩心叶中特异表达基因的启动子，以安全、高效地控制在幼嫩心叶中为害的第一代亚洲玉米螟初孵幼虫。 在本研究中，从玉米中克隆了一个新基因和它上游1.4kb的启动子序列(GenBankaccessionno.AY394010)。根据序列相似性，推测这个基因编码ADPG磷酸二酯酶(AGPPase)，具有抑制淀粉、蔗糖等糖类合成的功能，属于萌蛋白样蛋白质(germin-likeprotein，GLP)基因家族，因此，命名它为Zmglpl。进一步分析表明，Zmglpl基因没有内含子。考虑到Zmglpl基因和它的启动子在作物抗虫和品质改良基因工程上的潜在应用价值，将它们的序列提交到国家专利局申请了专利，Zmglpl基因的申请号为02158099.5，启动子的申请号为02158113.4。 为了解Zmglpl基因在玉米中的表达是否存在组织特异性和周期节律，Zmglpl基因在叶片中表达的细胞类型以及肩动子的哪些区段负责组织特异性和活性的调控，用Northern杂交、原位杂交和肩动子缺失突变方法对Zmglpl基因及其启动子进行分忻。 组织特异性分析显示，Zmglpl基因的mRNA在幼嫩心叶片中含量很高，在成熟叶片、幼嫩雄穗和雌穗轴中含量较低，在根、茎和未成熟种子中检测不到。原位杂交实验证明Zmglpl基因仅在幼嫩叶片中的叶肉细胞、韧皮部细胞和保卫细胞中表达，而不在维管束鞘细胞、表皮细胞和副卫细胞中表达。玉米是C4植物，C4植物的光合作用有两种类型细胞参与完成，CO2的初步固定发生于叶肉细胞，卡尔文循环以及淀粉、蔗糖的合成发生于维管束鞘细胞。Zmglpl基因的表达可能对抑制临时贮存性淀粉在叶肉细胞中的合成起到了一定作用，从而节省了将己糖从维管束鞘细胞转运到叶肉细胞的能量消耗。在维管束鞘细胞和淀粉的贮存器官(如种子)中，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化ADPG的合成，为淀粉的生物合成提供直接底物。Zmglpl基因不在这些细胞类型或器官表达，一方面使淀粉合成顺利完成，另一方面也避免ADPG合成与水解反应共存所造成的无效循环。 Northern分析显示，一天中ZmglplmRNA的丰度起伏变化很大，最高丰度发生于夜间，最低丰度发生于白天。随后，我们利用PCR方法将启动子缺失成不同长度的6个片段，连接上uidA基因，构建植物表达载体，使用农杆菌浸花法转化拟南芥植株。获得抗性植株用PCR和Southern杂交方法确认后，以转入单拷贝uidA基因的纯和体进行启动子活性、周期节律和组织特异性分析。 对转基因拟南芥叶片中的GUS活性分析表明，启动子片段△637和△1215活性最高，在一天中的平均活性约为35SCaMV启动子的3倍，△1316的活性最低。对转基因拟南芥不同发育阶段GUS活性分析显示，△637驱动的GUS活性直到主要发育阶段6.0时依然很高，之后慢慢降低，在主要发育阶段6.3(大约萌发40天)后快速下降。GUS染色分析显示，△13、△131、△637、△1027和△1316能够驱动uidA基因在拟南芥的连座叶、茎生叶、茎、花柄、萼片、花丝、柱头和绿色荚果的果皮中表达，而△1215不仅能驱动uidA基因在这些组织表达(除了幼苗的下胚轴)，还能在根中表达。这个结果表明，在-161nt60nt区段含有启动根部表达的顺式元件。 象其它的萌蛋白样蛋白质一样，Zmglpl的表达也存在周期节律。说明AGPPase的表达受质体内pH值和周期节律的双重调控。通过启动子缺失突变分析，我们发现了几段含有顺式作用元件的序列，并对可能参与调控转录因子进行了分析。结果表明，在16/8小时光照/黑暗周期条件下，-1245nt-739nt片段中含有一个节律应答元件和一个负调控元件，缺失掉这段序列会改变相位并大大提高GUS活性。从我们的结果还可以推测，另外一个顺式作用元件和一个负调控元件存在于-161nt-60nt和-349nt-739nt区段。当-161nt-60nt区段缺失掉时，GUS活性降到最低，周期节律也不复存在了。因此，-161nt-60nt区段是使Zmglpl基因正常表达的关键区段。 本研究不仅为进一步研究Zmglpl的功能奠定了基础，还证明了Zmglpl启动子，特别是△637片段是恰好符合抗玉米螟需要的具有组织特异性的强启动子。根据以上分析结果，我们将启动子△637和△13分别连接上人工合成的CryIA基因，构建植物表达载体，用农杆菌侵染法转化玉米自交系综3(Z3)和杂交系合作1号的TypeⅡ型愈伤组织，对它们在玉米中的活性、织特异性进行分析，目前正在筛选转基因愈伤。