硫化物是一种广泛分布的有毒物质。单环刺蜢隶属于螠虫动物门(Echiuroidea)、螠纲(Echiurida)、无管螠目(Xenopneusta)、刺蜢科(Urechidae)、刺螠属(Urechis),是一种海洋底栖生物,主要栖息于近海岸潮间带或潮下带泥性底质中。前期研究已经证明该物种具有较强的硫化物耐受与解毒能力。而线粒体硫化物氧化是生物体硫化物解毒的一种重要方式。硫醌氧化还原酶是线粒体硫化物氧化酶促反应链中的第一个酶。本研究克隆了单环刺螠硫醌氧化还原酶全长cDNA,通过重组表达获得具有活性的SQR,对其体外酶学特性和在体内mRNA水平、蛋白质水平以及硫化物诱导下的表达进行了分析,以期揭示单环刺螠SQR的生物学特性,为深入探讨硫化物代谢的分子机制以及开发单环刺蜢成为沿海硫化物代谢研究的模式生物提供科学依据。采用同源克隆策略结合RACE技术克隆得到硫醌氧化还原酶全长cDNA序列,结果显示单环刺蜢SQR (GenBank序列号:EF487538)全长2315 bp,其中开放阅读框长1356 bp,可以编码451个氨基酸。蛋白理论分子量为50.5 kDa,理论等电点为8.98。氨基酸序列中含有保守的FAD结合结构域、半胱氨酸(Cys202和Cys380)、组氨酸(His80和His294)和谷氨酸(Glu159)。采用荧光定量PCR技术对单环刺螠各组织SQR mRNA表达的分析结果表明：中肠表达量最高,肛门囊和体腔液细胞次之,体壁、呼吸肠表达量最低。构建原核表达载体pET28a-SQR和pET32a-SQR,转化大肠杆菌进行重组表达,结果显示SQR均以包涵体形式表达。纯化包涵体后,采用稀释复性的方法获得具有活性的单环刺蜢SQR。通过条件优化确定最佳稀释复性条件为pH 8.0,蛋白浓度20μg/ml,L-精氨酸浓度0.2 mol/L,还原型谷胱甘肽：氧化型谷胱甘肽=10:1,复性时间为96h。随后对复性蛋白的酶学特性进行分析,结果显示复性SQR比活为5.12μM/min/mg (25℃, pH 8.0),其最适作用温度为37℃,最适pH为8.5。采用米氏方程双倒数法测定两种底物硫化物和泛醌的Km分别为40.3μM和15.6μM。化学试剂EDTA和GSH对该酶具有激活作用,而Zn2+具有抑制作用。用纯化的重组SQR免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体后,采用免疫印迹实验对SQR的体内表达进行了分析,结果显示在体内该蛋白大约60 kDa。采用免疫组织化学技术对单环刺蜢各组织SQR的细胞表达定位进行研究,结果显示：SQR主要在各结构的上皮组织及近表面组织中表达,如体壁中SQR主要定位于上皮细胞的游离面和皮下的疏松结缔组织中；呼吸肠中主要定位于假复层纤毛柱状上皮的游离面；中肠中同样定位于上皮细胞的游离面；肛门囊中则定位于整个复层上皮中。然而,SQR在上述结构深层的肌肉层和体腔膜或浆膜中均无表达。荧光定量PCR检测显示硫化物暴露后单环刺蜢体壁和呼吸肠SQR mRNA表达均呈浓度和时间依赖的特征。体壁SQR mRNA在硫化物(25μM,50μM和150μM)暴露12h时显著性提高,并且随着硫化物暴露时间的延长,表达量持续提高,至硫化物暴露48h时达到峰值。呼吸肠SQR mRNA表达与体壁中的规律类似,但其表达量较体壁同时期高。采用间接竞争ELISA技术分析了硫化物暴露下单环刺蜢各组织(体壁、呼吸肠、肛门囊、中肠和体腔液细胞)中SQR的含量,结果显示各组织SQR含量在25μM硫化物处理下与对照组相比均没有显著性差异；体壁SQR含量变化呈时间依赖特征,表现为50μM硫化物中处理12h时显著性提高,24 h达到最高,48 h时降低；150μM硫化物处理2h时显著性提高,随着暴露时间的延续,含量持续提高,并在48h时达到最高；呼吸肠SQR表达规律与体壁的类似,但对应时间的含量更高；肛门囊SQR含量在50州硫化物处理6h时显著性提高,24h时达到最高,48 h时显著性降低,而150μM硫化物处理下与对照相比无显著性差异;中肠SQR含量在硫化物处理后均未表现出显著性提高；体腔液SQR含量在50μM组处理6h时显著降低,随着时间延长,含量一直维持在较低水平。150μM组处理分别于2h、24 h时呈显著下降。对各组织在50μM硫化物处理下线粒体中SQR活性进行检测,结果显示体壁、呼吸肠和肛门囊SQR酶活性变化均呈时间依赖的特征,且均在硫化物处理较短时间内与对照组呈现显著性提高(体壁2h；呼吸肠2h；肛门囊6 h),处理24 h达到最高,48 h时较前期显著降低。而中肠和体腔液只在硫化物处理48h时与对照相比显著性提高。由上我们得出,单环刺蜢硫化物氧化在体内多种组织中存在；其中以体壁、呼吸肠和肛门囊在虫体硫化物应激中的作用最为明显；SQR在体腔液和中肠酶促硫化物氧化中的作用不明显。本实验结果为深入探讨刺螠动物硫化物代谢机制提供了有价值的科学依据。