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研究一 基于DN患者转录组及临床表征的ZDHHC6分子发现研究背景和目的糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一,严重危害人类健康,其发病和进展机制亟待更深入地理解。近年来,棕榈酰化及其催化酶ZDHHC家族的相关研究取得较大进展,棕榈酰化修饰在各种病理和生理过程中的地位愈发受到重视,而目前尚未见到其与DN有关的研究报道。在此,我们使用DN患者转录组数据,对DN相关的ZDHHC家族分子进行发掘,重点关注了 ZDHHC6分子。方法分析挖掘DN患者肾小球转录组-临床表征相关研究的芯片数据,加权基因共表达网络分析（WGCNA）发现高度相关基因的簇,继而与估计的肾小球滤过率（eGFR）、蛋白尿等临床表型进行关联分析。使用DN转录组数据并结合Nephroseq数据库、肾脏单细胞数据库（KIT）等信息对ZDHHC家族尤其是被发现的ZDHHC6的表达与定位进行分析,免疫组化（IHC）染色观察其蛋白的表达,最后,对足细胞标志基因中的棕榈酰化底物分子进行通路分析以判断ZDHHC6可能参与的DN足细胞损伤机制。结果ZDHHC6是肾小球中表达量最高的ZDHHC家族成员。WGCNA发现turquoise、brown和purple三个模块与DN蛋白尿和eGFR关系密切,ZDHHC6是turquoise模块的枢纽基因,与eGFR成正比（r=0.59）、与蛋白尿成反比（r=-0.71）。转录组数据显示ZDHHC6与足细胞标志分子高度共表达,KIT的测序数据显示其主要表达于肾小球足细胞。IHC染色显示DN肾小球中ZDHHC6蛋白的表达降低,与芯片数据一致。足细胞可被棕榈酰化的标志分子的通路分析提示ZDHHC6参与细胞骨架调节。结论ZDHHC6主要在肾小球足细胞中表达,是肾脏表达量最高的ZDHHC家族成员。其在DN肾小球中表达降低,和DN临床表型关系密切,可能通过对足细胞骨架的调控参与DN发病和进展。研究二 ZDHHC6与肾小球功能研究目的利用斑马鱼模型研究zdhhc6在肾小球正常功能维持中的作用。方法使用MegAlign软件对zdhhc6氨基酸序列进行同源性分析。分离斑马鱼肾小球送测序以分析zdhhc家族的表达情况。使用CRISPR/Cas9技术构建zdhhc6敲除的斑马鱼G0,统计其表型,并用透射电镜观察其肾小球超微结构。免疫荧光双套色以了解zdhhc6蛋白的表达定位。使用足细胞标记的绿色荧光报告基因斑马鱼Tg（pod:eGFP）观察zdhhc6敲除的影响。使用全胚胎原位杂交技术（WISH）检测足细胞及其祖细胞以及肾小管标志物的表达变化。结果斑马鱼zdhhc6氨基酸序列与人ZDHHC6氨基酸序列的一致性达73.4%,斑马鱼肾小球测序数据显示zdhhc6为表达相对较高且稳定的zdhhc家族成员。CRISPR/Cas9敲除zdhhc6可导致斑马鱼出现心包水肿、全身水肿表型,透射电镜下可见这些斑马鱼肾脏发育障碍,主要表现为足突广泛融合。而向上述zdhhc6敲除的斑马鱼回输人或斑马鱼zdhhc6 mRNA均可逆转其水肿表型。免疫荧光双套色示zdhhc6蛋白与足细胞标志物synaptopodin表达共定位。敲除zdhhc6可显著降低Tg（pod:eGFP）胚胎中足细胞GFP的荧光表达。全胚胎原位杂交（WISH）结果显示,在zdhhc6敲除的斑马鱼中,足细胞标志物（podocin和nephrin）以及足细胞的祖细胞标志物（pax2a和lhx1a）的杂交信号均降低,而肾小管标志物（cdh17和megalin）的杂交信号无明显变化。结论zdhhc6敲除主要破坏足细胞的结构和功能,而对肾小管无明显影响。zdhhc6对斑马鱼肾小球正常功能的实现至关重要,其缺失可导致足突广泛融合,肾脏功能障碍,斑马鱼发生心包水肿或全身水肿表型。研究三 ZDHHC6调控足细胞稳态及机制研究目的DN转录组数据分析及斑马鱼zdhhc6相关研究都提示,ZDHHC6主要在肾小球足细胞中表达,且与足细胞的发育和功能维持密切相关。而足细胞损伤是肾小球疾病发生发展的关键环节,因此我们研究了 ZDHHC6对足细胞稳态的调控及相关的作用机制。方法MP法构建ZDHHC蛋白家族的系统发育树以寻找与ZDHHC6亲近的其它家族成员。使用siRNA特异性敲低人类足细胞ZDHHC6,并基于酰基-生物素交换（ABE）技术、采用无标记定量蛋白质组学方法检测ZDHHC6的棕榈酰化底物蛋白,之后对差异棕榈酰化底物蛋白进行富集分析,根据富集结果验证ZDHHC6影响的细胞功能,通过Annexin V-FITC/PI和TUNEL检测凋亡、鬼笔环肽染色观察足细胞骨架、DCFH-DA标记检测细胞活性氧、JC-1染色检测线粒体膜电位变化。结果ZDHHC6 siRNA仅能特异性地敲低ZDHHC6的表达,而对相近的ZDHHC1、ZDHHC5、ZDHHC8 没有影响。对 ZDHHC6 siRNA转染组（C6siRNA）和空白对照组（CTL）检测到的差异棕榈酰化蛋白进行的生物信息学分析,显著富集的KEGG通路中,“细胞生长和死亡”亚类中的Ferroptosis通路和Cell cycle通路以及与细胞骨架关系密切的 Leukocyte transendothelial migration 通路、Regulation of actin cytoskeleton 通路、Cell adhesion molecules 通路均提示,ZDHHC6 通过棕榈酰化参与了足细胞骨架系统的调控及氧化应激等过程,这与第一部分的生信分析结果一致。相关实验结果显示,ZDHHC6抑制和TGF-β1均可诱导足细胞凋亡、细胞骨架结构重排、活性氧生成和线粒体解聚,且抑制ZDHHC6可以进一步加重TGF-β1诱导的足细胞损伤。结论ZDHHC6在足细胞稳态维持中发挥重要作用。敲低ZDHHC6可引起足细胞凋亡增加,这可能与ZDHHC6敲低引起的足细胞骨架改变、活性氧产生增加以及线粒体膜电位下降有关。